高致病性禽流感實驗室檢測風險的分析及預防

章春燕 （遼寧省朝陽市動物疫病預防控制中心 122000）

高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI）是由正粘病毒科A型流感病毒屬流感病毒引起的以禽類為主的急性傳染病。高致病性禽流感因其在禽類中傳播快、危害大、病死率高，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病。近年在家禽身上分離出了H7N9亞型高致病性禽流感病毒，各地獸醫(yī)實驗室加強了高致病性禽流感的血清學及病原學檢測工作。我市的獸醫(yī)實驗室是生物安全Ⅱ級，承擔起了轄區(qū)內(nèi)H7亞型高致病性禽流感的感染抗體檢測工作，以及高致病性禽流感的病原學檢測工作。對于從事檢測工作的獸醫(yī)實驗室人員，做好自身防護，不被感染，使得獸醫(yī)實驗室生物安全顯得尤為突出。有效的防護不僅體現(xiàn)在對實驗室生物安全高度重視，還體現(xiàn)在操作人員對自身的科學防護措施上，筆者將這些經(jīng)驗和知識總結出來，以避免在進行高致病性禽流感抗體和病毒核酸檢測時，樣本中有害或潛在危害的生物因子對人、環(huán)境造成危害或潛在危害。

1 安全級別及檢驗活動的要求

實驗室的生物安全防護水平的分級是根據(jù)所操作的生物因子的危害程度和采取的防護措施而劃分。對于生物安全Ⅱ級獸醫(yī)實驗，我們要按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《實驗室生物安全認可準則》等相關要求，從事高致病性禽流感血清學及未經(jīng)培養(yǎng)核酸檢測工作，在做核酸檢測工作時，所有樣本操作要求在生物安全柜內(nèi)進行。嚴格執(zhí)行生物安全Ⅱ級獸醫(yī)實驗室對高致病性病原微生物的要求，不進行高致病性禽流感病毒的分離培養(yǎng)等超出實驗室安全等級的實驗操作活動。

2 風險分析和預防措施

高致病性禽流感在生物安全Ⅱ級獸醫(yī)實驗室的檢測項目主要有血凝和血凝抑制試驗，病毒核酸檢測。圍繞這兩項檢測活動所涉及的感染風險，主要體現(xiàn)在個人防護以及試驗操作過程中樣本與人、樣本與環(huán)境、以及樣本間的污染風險。

2.1 個人防護

生物安全實驗室的核心是安全，最重要的體現(xiàn)是檢測人員自身的安全。高致病性禽流感是主要是經(jīng)呼吸道感染，在實驗操作中，可能出現(xiàn)含病毒的液體飛濺或形成氣溶膠，因此檢驗人員檢測時應穿專用的工作服或防護服，戴防護較好的手套、口罩、帽子及眼鏡，條件好的實驗室可佩戴防化學飛濺面罩。實驗結束后，手套、鞋套、帽子、口罩等一次性防護用品要摘掉放入垃圾袋中待集中高壓滅菌處理，工作服可在紫外燈下進行消毒。實驗室內(nèi)長期備有75%的酒精、急救箱等急救設施，并定期檢查是否在保存期內(nèi)。

2.2 樣本的接收、處理和儲存

樣本在接收或轉運時，可能存在密封或包裝不嚴，液體撒漏，或者樣品中夾雜禽類的羽毛，造成空氣中有含病毒的粉塵，從而導致感染性材料等危險因子進入實驗室。樣本在接收或轉運時，嚴格的執(zhí)行實驗室生物安全標準操作規(guī)程，在生物安全Ⅱ級實驗室固定的接樣室接收樣本，然后通過專門的傳遞窗轉運樣本至樣品保存室，傳遞窗要定期進行紫外殺菌消毒。制備樣本時，在生物安全柜內(nèi)操作。檢測樣品做好詳細記錄，放入4℃冰箱保存，用以留樣的樣本確保容器蓋擰緊放入零下20℃以下的冰箱保存。操作結束后，用有效氯含量為200～400毫克/升的含氯消毒劑消毒地面、臺面。

2.3 血凝和血凝抑制試驗

如果血清樣本中有高致病性禽流感病毒陽性樣本，在檢測中由于操作不當，引起血清外溢，或者使用移液器不當產(chǎn)生氣溶膠造成操作臺面、器械及環(huán)境污染。試驗操作中稀釋血清樣本時，移液器操作要力度適當，盡量避免產(chǎn)生氣溶膠。盛裝血清的離心管試驗結束后要確認管蓋緊密閉合。試驗結束后，需用消毒液擦拭臺面、地面，將移液器放置在紫外燈下照射30分鐘，96孔U型反應板、試驗耗材等試驗廢棄物裝入黃色垃圾袋密封高壓滅菌30分鐘，方可帶出實驗室處理。

2.4 核酸檢測

本實驗室為熒光PCR檢測儀，核酸檢測的試驗步驟包括核酸提取，PCR反應體系的配置、PCR運行、結果分析等過程。操作人員除嚴格的執(zhí)行PCR實驗室分區(qū)的操作規(guī)定外，也要執(zhí)行工作服分區(qū)，在不同的實驗區(qū)穿該區(qū)特定的工作服，避免各工作區(qū)間的交叉污染。

核酸提取。棉拭子樣品檢測前應漩渦震蕩2～3分鐘，漩渦震蕩的過程中有可能管蓋松動引起液體滲出或泄露，造成環(huán)境及樣本間的污染。組織樣本在試驗前需研磨，手動研磨組織樣品時有可能用力過大使組織噴濺到外部造成污染。病毒裂解時，將離心管（EP）內(nèi)的裂解液與樣本液顛倒混勻時，可能使管蓋粘上病毒核酸，在開蓋進行下一步操作時使病毒核酸污染手套。移液器操作不當造成溶液滴漏或氣溶膠，高速冷凍離心機沒有配平或離心機內(nèi)安全罩沒有蓋緊，可能會產(chǎn)生氣溶膠，嚴重的可能使EP管碎裂，造成儀器設備的污染和損壞。棉拭子在漩渦震蕩前應確認管蓋密閉。研磨組織樣本在生物安全柜中進行試驗操作，在打開EP管時要雙手開管，減少手套與樣本的接觸范圍。要使用質(zhì)量好的EP管以防止管蓋密閉不嚴或操作不當?shù)纫蛩貙е碌母腥拘砸后w外溢和污染試驗設備。若發(fā)生管蓋不嚴或操作不當引起樣品泄露污染試驗設備，應及時用消毒液噴灑或擦拭生物安全柜臺面，移液器、儀器設備以及管外壁等污染的物體表面。使用高速冷凍離心機時，要在離心前保證配平離心管，蓋緊安全罩后啟動離心機。

PCR體系的配制。在該操作過程中可能因為陽性樣品操作不當引起灑溢，或者加入陽性核酸樣品時因為移液器操作不當形成氣溶膠導致整個實驗室環(huán)境被污染，并會影響以后實驗結果出現(xiàn)假陽性結果。若因各種操作不當因素導致樣本核酸的灑溢，要及時用含氯制劑的消毒液噴灑或擦拭并用紫外燈照射生物安全柜臺面、實驗室地面等被污染物體表面。

PCR運行。PCR管密閉不嚴或質(zhì)量不好是PCR管內(nèi)樣本液體泄露，造成PCR儀的污染，選用質(zhì)量上乘的PCR管，上機前確保PCR管密閉嚴實。

PCR實驗廢棄物處理及實驗室終末消毒。實驗活動結束后，相關的實驗廢棄物必須嚴格按照實驗室生物安全操作規(guī)范集中處理。實驗室內(nèi)的儀器設備可使用噴霧消毒劑消毒，消毒劑可選用有效氯為200～400毫克/升的含氯消毒劑溶液消毒。地面消毒先從外向內(nèi)噴灑一次，噴灑藥量為200～300毫升/平米，待室內(nèi)消毒完畢后，在從內(nèi)向外重復噴灑一次。實驗室在實驗間歇，可用甲醛熏蒸法徹底消毒。

3 結語

高效病性禽流感疫情形勢不容樂觀，獸醫(yī)工作者應當加強生物安全學習，做好實驗操作風險分析，通過預防措施將風險降到最低。