紅腺忍冬基源山銀花的化學成分

姚彩云，宋志軍，李漢浠，黃 健，王 碩

（西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023）

忍冬科忍冬屬(Lonicera)植物約有200種，其中許多品種的花或花蕾在中國民間作為金銀花入藥，其藤莖做為忍冬藤入藥，具有抗炎解熱、抗菌和抗病毒等功效。《中華人民共和國藥典》2010年版規(guī)定忍冬科忍冬屬植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾或帶初開的花為金銀花（Flos Lonicerae）的唯一來源；山銀花卻屬于多基源中藥，紅腺忍冬（L.hypoglaucaMiq）為山銀花的基源植物之一。[1]金銀花和山銀花具有相同的藥理藥效，其藥性甘，寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒，疏散風熱藥效。用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發(fā)熱。[1]金銀花的化學成分研究比較深入，主要有綠原酸（chlorogenic acid）、異綠原酸（isochlorogenic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、木犀草素(luteolin)、芳樟醇(linalool)、雙花醇及環(huán)烯醚萜苷等成分，[2-4]但是山銀花的化學成分研究報道不多，亟待加強研究。

紅腺忍冬（Lonicera hypoglaucaMiq.），又名毛柱忍冬，[5]分布于越南北部以及中國大陸的東南西南一帶，在廣西有廣泛的栽培。在廣西民間常作為山銀花入藥，主要用于清熱解毒，抗感冒，解暑。賀清輝等對紅腺忍冬藤莖的化學成分有過報道，[6-7]但是其花的化學成分未見報道。為了促進該植物開發(fā)利用，探索其活性物質(zhì)基礎，我們對采自廣西馬山縣古藺鎮(zhèn)的紅腺忍冬花及花蕾進行了化學成分的研究，從中分離鑒定了6個化合物。

1 實驗部分

1.1 材料來源

植物來源，采自廣西馬山縣紅腺忍冬種植基地的紅腺忍冬（Lonicera hypoglaucaMiq）花蕾及初開的花，經(jīng)廣西藥用植物園吳慶華教授鑒定為紅腺忍冬，其標本（GXMI 024673）保存在廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究所。

1.2 儀器及試劑

Sephadex LH-20凝膠(Pharmacia公司)；薄層層析(GF254)和柱層析硅膠(160～200和200～300目)為青島海洋化工廠產(chǎn)品。實驗中所用到的石油醚、甲醇、丙酮、氯仿等溶劑均為AR級，為天津富宇化工有限公司產(chǎn)品。

600兆核磁共振儀（Varian-600 MHz NMR Spectrometer）、液-質(zhì)聯(lián)用儀(Varian 320-MS)、分析型高效液相色譜儀(Varian 210)、制備型液相色譜儀（Varian Preparative HPLC 218）、旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（N-1100D-WD）。

1.3 提取與分離

粉碎后的干燥藥材1kg通過85%乙醇提取濃縮，得到乙醇提取物（82g），乙醇提取物分散在熱水（含乙醇20%）中，經(jīng)石油醚萃取除脂后，以乙酸乙酯萃取得到27g提取物。乙酸乙酯萃取部分經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇(50：1～1：1)梯度洗脫，TLC檢測合并相似部位得到五部分。第一部分主要為低極性脂肪酸等，棄去。第二部分經(jīng)LH-20凝膠柱層析甲醇洗脫，再結(jié)合ODS-C18反相制備HPLC或硅膠Flash柱層析，最后經(jīng)重結(jié)晶分離純化，得到化合物3(12mg)、4(8mg)；第三部分經(jīng)反相柱層析，以甲醇-水（5%～95%）梯度洗脫，結(jié)合小LH-20凝膠柱層析得到化合物1(23mg)和2(18mg)；第四部分經(jīng)LH-20凝膠柱層析以甲醇洗脫，后經(jīng)甲醇溶解，濃縮，冷凍結(jié)晶，得到化合物5；（12mg）第五部分經(jīng)LH-20凝膠柱層析甲醇洗脫，TLC檢測合并后，經(jīng)制備高效液相色譜，得到化合物6（5mg）.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物1：豆甾醇

化合物1，白色針狀晶體（石油醚-乙酸乙酯），易溶于氯仿、二氯甲烷，紫外不顯色，硫酸乙醇溶液中加熱顯褐紅色；mp 167～169℃.核磁數(shù)據(jù)與彭樹林等[8]報道的豆甾醇數(shù)據(jù)基本一致，經(jīng)分析HPLC（varian 210）測定，與豆甾醇的標準品具有相同的保留時間。色譜條件：色譜柱，ODSC-18液相色譜柱，4.6mm×250mm，5μm.流動相：甲醇，流速：0.7ml.min-1.柱溫：25℃.紫外檢測波長：210nm.故鑒定為豆甾醇（stigmasterol），波譜數(shù)據(jù)歸屬如下。

1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δH：3.53(1H，m，H-3)，5.36(1H，d，J=4.65 Hz，H-6)，0.71(3H，s，H-18)，0.93(3H，s，H-19)，1.02(3H，s，H-21)，5.16(1H，dd，J=15.15，8.65 Hz，H-22)，5.02(1H，dd，J=15.1，8.75 Hz，H-23)，0.83(3H，s，H-26)，0.81(3H，s，H-27)，0.85(3H，d，J=1.4 Hz，H-29).

13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δC：37.3(C-1)，29.3(C-2)，71.9(C-3)，39.9(C-4)，140.8(C-5)，121.7(C-6)，32.0(C-7)，31.9(C-8)，50.2(C-9)，36.6(C-10)，21.1(C-11)，39.8(C-12)，42.3(C-13)，56.0(C-14)，24.4(C-15)，28.9(C-16)，56.9(C-17)，12.0(C-18)，19.4(C-19)，40.5(C-20)，21.2(C-21)，138.3(C-22)，129.4(C-23)，51.3(C-24)，31.7(C-25)，19.0(C-26)，21.0(C-27)，25.4(C-28)，12.2(C-29).

2.2 化合物2：反式阿魏酸

化合物2為無色針晶，TLC(GF254)紫外燈（254 nm）下顯深蘭色熒光，噴硫酸香草醛乙醇顯色劑顯黃色斑點。1H-NMR顯示它有一個ABX自旋耦合系統(tǒng)，及一個反式雙鍵，一個甲氧基。低場顯示有一個活波氫，推測該化合物為4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸或3-羥基-4-甲氧基苯丙烯酸，與反式阿魏酸標準品在多種溶劑系統(tǒng)薄層層析其Rf值均相同；經(jīng)分析型HPLC（varian 210）檢測，與反式阿魏酸標準品具有相同的保留時間，色譜條件：色譜柱，ODSC-18液相色譜柱，4.6mm×250mm，5μm.甲醇-水-冰乙酸（25∶75∶0.75）（v：v：v），pH=3；流速1.0 mL.min-1，檢測波長：320nm.因此將其鑒定為反式阿魏酸（trans-ferulic acid）.[9]

1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δH：3.80(3H，s，OCH3)，6.22(1H，d，J=16.1 Hz，H-8)，6.95(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，7.05(1H，s，H-2)，7.00(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.53(1H，d，J=16.1 Hz，H-7).

2.3 化合物3：3，3'-二甲氧基鞣花酸

化合物3為淺黃色粉末，溶于丙酮、甲醇、四氫呋喃等有機溶劑，ESI-MSm/z：329.3[M-H]—.1H及13C-NMR數(shù)據(jù)與蘇志恒等報道的3，3'-二甲氧基鞣花酸數(shù)據(jù)基本一致，[10]故鑒定為3，3'-二甲氧基鞣花酸。

其波譜數(shù)據(jù)歸屬如下。

1H-NMR(CD3COCD3，600 MHz)δH：7.65(2H，s，H-5，5)，4.09(6H，s，3，3'-OCH3).

1C-NMR(CD3COCD3，150 MHz)δC：109.3(C-5，5)，112.7(C-1，1)，115.0(C-6，6)，141.6(C-3，3)，144.7(C-2，2)，153.2(C-4，4)，159.4(C-7，7)，61.9(3，3'-OCH3).

2.4 化合物4：灰氈毛忍冬皂苷乙

化合物4，白色粉末，mp 229～231℃；硫酸-香草醛顯紫紅色；ESI-MS提示分子量為1398；與灰氈毛忍冬皂苷乙的標準品（購自中檢所）在正相及反相TLC中的Rf值一致，1H-NMR主要數(shù)據(jù)特征與文獻[6]報道的灰氈毛忍冬皂苷乙（macranthoidin B）一致，水解后得到的苷元經(jīng)13C-NMR證明為灰氈毛忍冬皂苷乙的苷元，[11]故鑒定為灰氈毛忍冬皂苷乙。

ESI-MS m/z 1421.5[M+Na]+，1397.6[M-H]—

1H-NMR(CD3OD，600MHz)δH：0.72，0.83，0.90，0.92，0.97，1.15(s，6×CH3)，1.26(3H，d，J=6.0 Hz，Rha-Me)，4.12(1H，m，H-3)，5.34(1H，m，H-12).

水解后得到的苷元的13C-NMR(DMSO-d6，150MHz)數(shù)據(jù)δC：39.4(C-1)，26.0(C-2)，80.7(C-3)，43.2(C-4)，47.1(C-5)，18.1(C-6)，32.7(C-7)，38.6(C-8)，47.8(C-9)， 36.6(C-10)， 23.2(C-11)， 123.3(C-12)，143.6(C-13)，41.7(C-14)，29.8(C-15)，23.4(C-16)，46.7(C-17)，41.3(C-18)， 45.8(C-19)，30.3(C-20)，33.6(C-21)，32.5(C-22)，63.6(C-23)，13.7(C-24)，15.8(C-25)，17.2(C-26)，25.8(C-27)，176.4(C-28)，32.4(C-29)，22.8(C-30).

2.5 化合物5：馬錢子苷

化合物5，白色立方結(jié)晶(甲醇)，薄層層析中，硫酸-香草醛顯色后呈紫色斑點。質(zhì)譜提示其分子量為390，mp 220-222℃.1H-NMR及13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻報道的馬錢子苷（Loganin）一致，[11-12]故鑒定為馬錢子苷。

ESI-MSm/z，[M+H]+=391，[M-H]—=389

1H-NMR(600 MHz，in CD3OD+CDCl3)： 7.49(1H，s，H-3)，5.16(1H，d，J=4.8，H-1)，4.61(1H，d，J=7.8，H-1')，3.05(1H，q，J=8.4，H-5)，2.19(1H，ddd，J=13.8，7.8，1.2，H-6a)，1.59(1H，ddd，J=13.8，7.8，2.4，H-6b)，4.13(1H，brt，J=4.2，H-7)，1.82(1H，m，H-8)，2，02(1H，td，J=9.0，4.8，H-9)，1.04(3H，d，J=7.2，H-10)，3.21(1H，t，J=8.4，H-2')，3.84(1H，dd，J=12.0，2.4，H-6'a)，3.69(1H，dd，J=12.0，5.4，H-6'b)，3.33(1H，dd，J=9.6，7.2，H-4')，3.37(1H，m，H-5').

13C-NMR(151 MHz，CD3OD and CDCl3)δC(ppm)：169.16(C-11)，151.63(C-3)，113.42(C-4)，99.44(C-1')，97.17(C-1)，77.36(C-5')，77.25(C-3')，74.50(C-2')，73.96(C-7)，70.83(C-4')，62.24(C-6')，51.72(-OCH3)，45.81(C-9)，42.06(C-6)，41.46(C-8)，31.44(C-5)，13.23(C-10).

2.6 化合物6：山柰酚

化合物6為黃色固體。質(zhì)譜提示該化合物的分子量為286.1H-NMR中δH12.27（1H，brs），提示含有5-OH；δH8.12（2H，d，J=8.4Hz）與δH6.87（2H，d，J=9.0Hz）提示為B環(huán)上的AA'BB'偶合系統(tǒng)；δH6.35（1H，d，J=1.8 Hz）與δH6.14（1H，d，J=2.0 Hz）提示為A環(huán)上的間位取代氫。1H-NMR（600MHz，THF）和13C-NMR（150MHz，THF）數(shù)據(jù)如下。波譜數(shù)據(jù)與文獻報道的山奈酚一致，[13]故鑒定為山柰酚。

ESI-MSm/z287[M+H]+，285[M-H]

1H-NMR(THF)數(shù)據(jù) （δH，ppm）：9.46(1H，s，3-OH)，12.27(1H，s，5-OH)，6.14(1H，d，J=1.8，H-6)，6.35(1H，d，J=1.8，H-8)，8.12(2H，d，J=8.4，H-2'，6')，6.87(2H，d，J=8.4，3'，5').

13C-NMR(THF)數(shù)據(jù)（δC，ppm）：146.9(C-2)，134.7(C-3)，176.8(C-4)，157.8(C-5)，99.0(C-6)，165.1(C-7)，94.0(C-8)，162.7(C-9)，103.4(C-10)，123.5(C-1')，130.2(C-2'，6')，160.3(C-4')，116.1(C-3'，5').

以上化合物中的灰氈毛忍冬皂苷乙（4）、馬錢子苷（5）及山柰酚（6）在忍冬屬植物中多有報道。而豆甾醇（1）反式阿魏酸（2）及3，3'-二甲氧基鞣花酸（3）為首次在該屬植物報道。阿魏酸具有鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作用，[14]山柰酚具有抗菌，抗炎、抗氧化、解痙、抗?jié)?、利膽利尿劑、止咳等活性，馬錢子苷對非持異性免疫功能有增強作用，具有良好的抗炎、抗菌、鎮(zhèn)咳及祛痰等藥效，灰氈毛忍冬皂苷乙作為藥典中山銀花的指標成分，有消炎及的抗癌作用。鞣花酸類成分在大量體外組織及小動物模型中都具有抗增生和抗氧化的活性。[15]

這些化學成分基本反映了紅腺忍冬基源山銀花的物質(zhì)基礎，為其活性成分的研究提供參考。

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