Toll 樣受體9與自身免疫性糖尿病

鄭金玨 陳夢(mèng)蝶 綜述 鄭超 審校

1 Toll樣受體概況

Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)屬1型跨膜蛋白，是哺乳動(dòng)物主要的天然模式識(shí)別受體, 參與病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的識(shí)別，引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)多種與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)。Toll樣受體在不同種生物體內(nèi)保持高度的同源性，目前已證實(shí)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的TLRs有TLR1-TLR13共13種[2，11]。目前已經(jīng)有7種TLR被鑒定出其相應(yīng)配體[3,12]，如TLR1，2，6可以協(xié)作識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖（PGN）和細(xì)菌脂蛋白（BLP），TLR3可以特異性識(shí)別病毒分子中的dsRNA，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖（LPS）是TLR4的激動(dòng)劑，TLR5識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白，TLR7和TLR8可以特異性識(shí)別ssRNA[4]，TLR9主要參與并激活由病原體CpG基序刺激后細(xì)胞信號(hào)通路,引起大量炎性因子的產(chǎn)生[5,7]。

2 TLR9的生物學(xué)特性

2.1 TLR9的結(jié)構(gòu)與分布

人類TLR9基因位于第3號(hào)染色體（3p2113）,有2個(gè)外顯子組成，全長(zhǎng)約5kb。TLR9基因與MyD88基因相連，以單外顯(monoexonic)或者雙外顯(biexonic)等兩種最常見(jiàn)的拼接方式表達(dá)[8,12]。TLR9蛋白由1032個(gè)氨基酸編碼，其分子結(jié)構(gòu)與TLR家族其他成員一樣，都是由胞膜外區(qū)、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)組成。小鼠的胞外區(qū)LRR有16個(gè)，而人有18個(gè)[9]。TLR9蛋白在脾臟中表達(dá)量最高，其次是卵巢、外周血白細(xì)胞，胸腺、肺、腸、前列腺、腦和胰腺。在各種免疫細(xì)胞中TLR9的表達(dá)量也有很大差異，尤其是記憶性B淋巴細(xì)胞和胞漿樣樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)表達(dá)最為豐富[10]。

2.2 TLR9的配體

研究證實(shí)，TLR9的天然激動(dòng)劑是CpG。CpG是存在于細(xì)菌或病毒基因組中出現(xiàn)頻率較高的非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(cytosine phosphate—guanosine，CpG)序列，這些短核苷酸序列具有免疫活性。將含有CpG基序的細(xì)菌或病毒DNA稱CpG DNA，人工合成的含有CpG基序的寡核苷酸(oligodeexynucleotide，ODN)序列稱CpG ODN。Melinda A[11,14]等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用CpG寡核苷酸序列刺激TLR9+的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和T47-D，可以降低血清基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）的表達(dá)，而在TLR9-的乳腺癌細(xì)胞MCF-7中無(wú)此現(xiàn)象。Labzhinov PA等[3]研究發(fā)現(xiàn)，敲除了TLR2，TLR4基因的小鼠，對(duì)CpG DNA仍具有反應(yīng)性，比如脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子以及樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟加快等。而敲除TLR9基因的小鼠(TLR9-/-)則無(wú)以上反應(yīng)。這些研究結(jié)果都說(shuō)明TLR9通路的激活與CpG DNA有緊密聯(lián)系。

2.3 TLR9對(duì)CpG DNA/ODN的攝取

無(wú)論是來(lái)自細(xì)菌或者病毒的CpG DNA還是人工合成的CpG DNA都可通過(guò)細(xì)胞的非序列依賴性胞吞作用攝入細(xì)胞體內(nèi)，形成內(nèi)體。Vollmer J等[14]發(fā)現(xiàn)，包含CpG DNA/ODN的內(nèi)體在P13激酶、Rab5以及GTP結(jié)合蛋白的調(diào)控下，不斷成熟，酸化，進(jìn)而激活TLR9介導(dǎo)的信號(hào)途徑。但是CpG骨架的結(jié)構(gòu)影響細(xì)胞對(duì)其攝取，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)CpG ODN經(jīng)過(guò)硫代磷酸化修飾后更容易被細(xì)胞攝取，而且增強(qiáng)了原有序列的免疫刺激活性，而甲基化修飾卻無(wú)此作用[13]。

2.4 TLR9-MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

CpG-ODN與細(xì)胞表面接觸后，通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)體形式，隨著內(nèi)體的成熟、酸化，TLR9被招募并識(shí)別CpG-ODN，兩者結(jié)合形成二聚體[14，15]。髓樣細(xì)胞分化因子88（MyD88）包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，TIR結(jié)構(gòu)域位于C末端，N末端有個(gè)“死亡”結(jié)構(gòu)域，與白介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）的死亡結(jié)構(gòu)域高度同源，在受刺激后可被招募。因此結(jié)合了CpG-ODN的TLR9招募MyD88分子與之結(jié)合，形成MyD88-TLR復(fù)合物。該復(fù)合物與白介素-1相關(guān)蛋白激酶（IRAK）4結(jié)合并激活I(lǐng)RAK 4后，反過(guò)來(lái)作用于IRAK 1，使之高度磷酸化。IRAK 1高度磷酸化后從之前的復(fù)合物上解離下來(lái)，與轉(zhuǎn)接蛋白TNF受體相關(guān)因子6（TRAF6）相互作用形成復(fù)合體[15,16]。TRAF6介導(dǎo)的途徑有好多條，其中一條通過(guò)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）激活激酶1(TGF-activated kinase 1,TAK1)，活化的TAK1順序激活I(lǐng)KK,IKK的激活使IκB磷酸化從NF-κB上脫落并被泛素化，使得NF-κB由抑制狀態(tài)被激活從而引發(fā)NF-κB轉(zhuǎn)位入核并激發(fā)一系列后續(xù)免疫反應(yīng)。另一條轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是P38介導(dǎo)的MAPK途徑。這是一條經(jīng)典炎性反應(yīng)途徑，又稱為NAPK應(yīng)急信號(hào)通路。Yiqun Zhang等[15]也曾報(bào)道過(guò)，活化的TRAF6可通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)蛋ECSIT，作用于MAP-3的激酶MEKK-1，經(jīng)過(guò)P38進(jìn)一步刺激絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），進(jìn)而激活c—Jun／Fos，最終引起免疫應(yīng)答。

3 TLR9介導(dǎo)的信號(hào)通路與自身免疫性糖尿病發(fā)病

近來(lái)的一些重要研究提示：TLR9信號(hào)通路不僅在感染誘導(dǎo)的炎癥損傷中起到作用，而且在自身免疫性糖尿病的發(fā)病中也起到重要作用。Wong等[17]將NOD小鼠的TLR3和TLR9兩個(gè)基因分別敲除，結(jié)果在TLR3缺如和雜合型NOD小鼠中，發(fā)病率無(wú)顯著性差異。然而TLR9缺如小鼠則較TLR9雜合子的NOD小鼠表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用。Zhang等[15]最近觀察到：?jiǎn)为?dú)或聯(lián)合使用CpG寡脫氧核苷酸或CD40(共刺激分子)能激活致糖尿病性T細(xì)胞和誘發(fā)8.3-TCR轉(zhuǎn)基因鼠糖尿病的發(fā)病。而TLR9抑制肽段則阻滯了8.3-TCR轉(zhuǎn)基因鼠糖尿病的發(fā)病，氯喹（TLR受體阻滯劑）延緩了NOD鼠的糖尿病的發(fā)病，同時(shí)觀察到胰腺旁淋巴結(jié)中的DC的激活減少。

TLR9介導(dǎo)的免疫信號(hào)通路，幾乎是NF-κB依賴性的，NF-κB在炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和抗體釋放中起到至關(guān)重要的作用。CpG-DNA刺激TLR9-MyD88信號(hào)通路，導(dǎo)致IRAK和TRAF6的磷酸化，最終通過(guò)激活NF-κB起作用[14.15,16]。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，CpGDNA/ODN激活TLR9后,哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答均被激活，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以Th1型占優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。但是，對(duì)于CpGODN/TLR9介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的機(jī)制還有一些疑問(wèn)，如與病毒感染密切相關(guān)的自身免疫性內(nèi)糖尿病是如何通過(guò)TLR9介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變細(xì)胞因子及共刺激分子表達(dá)、影響APCs功能，從而引起T細(xì)胞過(guò)度活化，產(chǎn)生針對(duì)自身抗原的T細(xì)胞，打破免疫耐受等具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。相信隨著對(duì)TLR9信號(hào)通路研究的不斷深入，自身免疫性糖尿病的發(fā)病機(jī)制將會(huì)得到進(jìn)一步的闡明，必然會(huì)提高對(duì)該類糖尿病的預(yù)防和治療水平。

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