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    疏血通注射液對兔耳增生性瘢痕MMP-2和ɑ-SMA表達(dá)的影響

    2019-02-19 09:10:50施建飛陳曉棟
    中國麻風(fēng)皮膚病雜志 2019年1期
    關(guān)鍵詞:通組曲安纖維細(xì)胞

    施建飛 陳曉棟

    增生性瘢痕(HS)是以成纖維細(xì)胞過度增殖為特征的皮膚纖維增殖性疾病,其特征是由成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[1]和基于膠原,如膠原蛋白I和膠原蛋白III的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的代謝紊亂[2]。最常繼發(fā)于燒傷后,是消防員燒傷康復(fù)的主要后遺癥。增生性瘢痕不僅導(dǎo)致外觀變化還影響器官和組織功能,給患者生理和心理帶來極大痛苦,目前治療的手段多是在瘢痕形成后才開始干預(yù),防治策略多為抑制成纖維細(xì)胞增殖、促其凋亡、調(diào)節(jié)膠原代謝,治療方法多樣[3],然而效果不甚理想。

    在瘢痕組織中,成纖維細(xì)胞發(fā)揮重要作用,因此,防治瘢痕形成與發(fā)展的重點是抑制成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活性。臨床實踐中,糖皮質(zhì)激素,如曲安奈德、復(fù)方倍他米松注射液等單獨或聯(lián)合其他藥物,如5-FU等進(jìn)行瘢痕內(nèi)注射,是治療增生性瘢痕的常用方法之一[4]。但是這些藥物本身的毒副作用及療效不確定,使之具有局限性。從中藥和天然藥提取物中篩選抗皮膚瘢痕的功效藥物,該方向有較大的研究價值。

    疏血通的主要成分水蛭、地龍,抗凝、溶栓,對血小板聚集有一定抑制作用、對血液流變學(xué)的改變有作用。靜脈滴注疏血通,抑制抗血小板的聚集,改善微循環(huán),提高創(chuàng)面肌層組織血流的供應(yīng),改善局部細(xì)胞的代謝,增加營養(yǎng),從而有利于組織的早期修復(fù)[5]。疏血通局部注射用于增生性瘢痕的治療未見相關(guān)報道,本實驗以兔耳增生性瘢痕模型[6]為研究對象,局部注射疏血通,觀察并研究它對增生性瘢痕組織作用的影響,為藥物的臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 選擇新西蘭白兔9只,由南通大學(xué)實驗中心供應(yīng)。雌性5只,雄性4只,體質(zhì)量2.0~2.5 kg,兔耳完整健康,分籠進(jìn)行喂養(yǎng).按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組,每組3只,所有動物一般資料無顯著性差異。所有實驗按照國際實驗動物管理委員會指南進(jìn)行。

    1.2 方法

    1.2.1 動物模型建立 參照李薈元等[6]模式建立兔耳增生性瘢痕模型,用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)作耳緣靜脈麻醉,皮膚消毒,沿長軸避開可見血管,利用角膜環(huán)鉆作直徑1cm圓形創(chuàng)面,創(chuàng)面距離1cm以上,去掉兔耳全層皮膚并用刮勺完全刮除軟骨膜,創(chuàng)緣徹底止血,每耳6處,共108個創(chuàng)面,術(shù)后創(chuàng)面暴露,待其自行愈合。

    1.2.2 藥物注射 建模后30 d,待創(chuàng)面上皮化后,將其隨機(jī)分為3組,空白對照組,曲安奈德組,疏血通組,每組3只。疏血通組和曲安奈德組分別注射疏血通注射液和曲安奈德注射液,空白對照組注射等劑量生理鹽水。注藥方式參照文獻(xiàn)[7]:用微量注射器從創(chuàng)面四周的正常皮膚進(jìn)針向創(chuàng)面基底部及創(chuàng)面灶內(nèi)局部注射,注藥量為50 μL/創(chuàng)面,3天給藥1次,共6次。

    1.2.3 瘢痕增生指數(shù)測量 給藥后20 d,在無菌條件下取材,用螺旋測微儀測算瘢痕厚度及瘢痕四周正常皮膚厚度[8],瘢痕增生指數(shù)=瘢痕厚度/正常皮膚厚度,記錄數(shù)據(jù)。

    1.2.4 HE染色 作HE染色時,取出切片在37℃孵育箱中進(jìn)行回溫,將回溫好的切片,水中浸泡30~60 s左右。染色前用蒸餾水潤濕組織1~2 min,核染液染色5 min左右,水洗3~5 s,分色劑中蘸2下,水沖。槳染液染色2 min,按照梯度脫水,吸干,封片鏡檢。

    1.2.5 VG染色 VG天青石藍(lán)染色液滴染2~3 min,稍水洗, Mayer蘇木素染色液滴染2~3 min。稍水洗,酸性乙醇分化液分化1~2 s。流水沖洗10 min。用配制好的改良VG染液滴染1~2 min。急速用水洗一下,即用95%乙醇快速分化脫水,無水乙醇脫水3次,每次5~10 s。二甲苯透明3次,每次1~2 min,中性樹膠封片鏡檢。

    1.2.6 qRT-PCR 引物序列:GAPDH上游5’-CGATGGTGAAGGTCGGAGTG-3’,下游5’-ACATGTAGACCATGTAGTGGAGG -3’;MMP2 上游5’-CACTGGTGTTGGGGGAGATT-3’,下游5’-CACGGACCACTTGACCTTCT -3’;ɑ-SMA 上游5’-TGTCAGGAATCCCGTGAAGC-3’,下游5’-CATTGTCACACACAAGGGCG-3’;按試劑盒說明,在反應(yīng)管中依次加入試劑。GAPDH作為內(nèi)參 .采用2-△△CT的方法分析增生性瘢痕組織中 mRNA水平。

    1.2.7 Western Blot 實驗方法參照文獻(xiàn)所述[9],組織稱重,加入裂解液,充分勻漿,離心后,取上清,測定蛋白濃度。凝膠電泳后,轉(zhuǎn)膜,封閉,加一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h, 顯影。GAPDH作為內(nèi)參。采用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行檢測。

    2 結(jié)果

    2.1 瘢痕厚度及瘢痕增生指數(shù) 兔耳增生性瘢痕模型建立,待創(chuàng)面上皮化,給藥后20 d,在無菌條件下取材,測量瘢痕厚度及瘢痕四周正常皮膚厚度,并計算瘢痕增生指數(shù),結(jié)果顯示:與空白對照組相比,曲安奈德組和疏血通組瘢痕厚度明顯降低,瘢痕增生指數(shù)降低。 曲安奈德組和疏血通組兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

    2.2 HE染色 我們采取HE染色的方法驗證增生性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞表達(dá)情況,結(jié)果顯示:空白對照組中有較多的成纖維細(xì)胞,而曲安奈德組與疏血通組成纖維細(xì)胞相對較少(圖1)。

    2.3 VG染色 我們采取VG染色的方法進(jìn)一步驗證增生性瘢痕組織中膠原纖維表達(dá)情況,結(jié)果顯示:空白對照組膠原纖維排列相對較為密集,曲安奈德組與疏血通組成膠原纖維排列相對較為稀疏(圖2)。

    表1 各組瘢痕厚度及瘢痕增生指數(shù)比較

    注:與空白對照組相比,曲安奈德組和疏血通組瘢痕厚度明顯降低***P<0.001,與空白對照組相比,曲安奈德組和疏血通組瘢痕增生指數(shù)降低**P<0.01

    2.4 qRT-PCR檢測增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA的mRNA水平的變化 我們采取qRT-PCR的方法檢測增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA mRNA水平表達(dá)變化,結(jié)果顯示:與空白對照組相比,曲安奈德組和疏血通組MMP-2 mRNA表達(dá)顯著降低(***P<0.001),ɑ-SMA mRNA表達(dá)降低(**P<0.01)。曲安奈德組和疏血通組兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2、圖3)。

    2.5 Western blot檢測瘢痕組織中MMP-2和ɑ-SMA表達(dá)相對灰度值和蛋白表達(dá)變化 我們采取Western blot方法檢測增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA 蛋白表達(dá)變化,結(jié)果顯示:與空白對照組相比,曲安奈德組和疏血通組MMP-2和ɑ-SMA蛋白表達(dá)降低(**P<0.01,*P<0.05)。曲安奈德組和疏血通組兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3、圖4)。

    表2 2-△△CT方法分析增生性瘢痕組織中mRNA水平

    注: 與空白對照組相比,***P<0.001,**P<0.01

    表3 Image J分析增生性瘢痕組織中蛋白表達(dá)相對灰度值

    注:與空白對照組相比,**P<0.01,*P<0.05

    1a、1b、1c分別為空白對照組,曲安奈德組,疏血通組,空白對照組中有較多的成纖維細(xì)胞,而曲安奈德組與疏血通組成纖維細(xì)胞相對較少

    圖1 給藥20 d各組兔耳瘢痕HE染色結(jié)果(×400)

    2a,2b,2c分別為空白對照組,曲安奈德組,疏血通組,可見空白對照組膠原纖維排列相對較為密集,曲安奈德組與疏血通組成膠原纖維排列相對較為稀疏,(膠原纖維為鮮紅色,肌纖維、胞質(zhì)及紅細(xì)胞為黃色,細(xì)胞核為藍(lán)褐色)

    圖2 給藥 20 d 各組兔耳瘢痕VG染色結(jié)果(×400)

    圖3 增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA mRNA水平 3a:MMP-2 mRNA水平 與空白對照組比較***P<0.001,3b:ɑ-SMA mRNA水平 與空白對照組比較,**P<0.01圖4 增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA蛋白表達(dá)變化 與空白對照組相比,**P<0.01;*P<0.05

    3 討論

    Retz在1789年描述了皮膚瘢痕,它們的組織學(xué)外觀是由于成纖維細(xì)胞過度增殖,真皮層細(xì)胞凋亡受到抑制后的皮膚受損[10]。HS有時會產(chǎn)生瘢痕攣縮,特別是對于關(guān)節(jié)的瘢痕攣縮,會導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。有許多治療增生性瘢痕的方法包括糖皮質(zhì)激素瘢痕組織內(nèi)注射、壓力療法、硅膠產(chǎn)品外用、手術(shù)切除、激光和冷凍治療等。其中,曲安奈德或復(fù)方倍他米松注射液通過局部注射治療增生性瘢痕[11],藥物的效果比較明顯,但反復(fù)多次局部注射對機(jī)體影響較大,如:注射時疼痛劇烈;停藥后局部發(fā)紅、水腫、灼熱、瘙癢、干燥、脫屑等[12]。根據(jù)文獻(xiàn)報道,曲安奈德對瘢痕成纖維細(xì)胞的生長分化能力和膠原的產(chǎn)生有一定的抑制作用[13]。

    據(jù)文獻(xiàn)報道[14]MMP2的活性在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中顯著增加,當(dāng)MMP2升高時促進(jìn)瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞中的遷移活動。ɑ-SMA一直被認(rèn)為是區(qū)別成纖維細(xì)胞與轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞的可靠標(biāo)記,以及組織纖維化水平[15]。在瘢痕形成的病理過程中,成纖維細(xì)胞被激活分化成肌成纖維細(xì)胞表達(dá)過多的a-SMA,并產(chǎn)生大量的ECM如膠原蛋白I和膠原蛋白III[16].a-SMA是一種在血管平滑肌和肌成纖維細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì),是增生性瘢痕的特征性標(biāo)志并通過肌成纖維細(xì)胞收縮對發(fā)病機(jī)制有顯著意義[17]。

    血管生成對傷口愈合和組織再生是必不可少的,特別是在愈合的增殖階段。在傷口愈合過程的早期階段,觀察到穩(wěn)健的新血管形成。人們普遍認(rèn)為,炎癥和傷口愈合延遲與瘢痕形成有關(guān)。盡管血管生成對傷口愈合至關(guān)重要,但許多研究表明過度的血管生成反應(yīng)導(dǎo)致瘢痕形成[18]。微血管形成在增生性瘢痕中比在正常營養(yǎng)性瘢痕中更劇烈。疏血通的主要成分是水蛭與地龍,水蛭對凝血酶的產(chǎn)生有一定的抑制作用,是一種功能比較強(qiáng)的凝血酶抑制劑,對微循環(huán)的改善和抗凝血功能有明顯的作用[19]。靜脈滴注疏血通具有對抗血小板的聚集和改善微循環(huán)的作用, 提高創(chuàng)面肌層組織血流的供應(yīng)改善局部細(xì)胞的代謝,增加營養(yǎng),祛腐生肌,從而有利于組織的早期修復(fù)[5]。

    本實驗觀察治療后兔耳增生性瘢痕的外觀形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn),疏血通組瘢痕的顏色有相對變淺的趨勢,厚度也稍有降低。對成纖維細(xì)胞和膠原纖維的表達(dá)有一定的抑制作用,疏血通局部注射后能降低瘢痕組織內(nèi)ɑ-SMA和MMP-2的表達(dá),一定程度上抑制瘢痕的形成。

    疏血通注射液可能通過降低MMP2和ɑ-SMA的表達(dá),對增生性瘢痕有一定的抑制效果,這為疏血通局部注射治療增生性瘢痕的臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

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