細胞因子IL-2和IL-4對病毒保護性抗原基因真核表達影響的研究

韋冠東，張元鑫，湯德元*，曾智勇，馬 萍，劉 霞，王洪光，李 達

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴陽 550008）

DNA疫苗的免疫效果受動物個體差異的影響較大，如何提高和改善DNA疫苗的免疫效果是當今DNA疫苗研究的熱點，近年來研究發(fā)現(xiàn)：與DNA疫苗聯(lián)合應用的細胞因子可通過不同的環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)和增強DNA疫苗免疫效應，白細胞介素作為免疫佐劑能協(xié)同DNA疫苗取得較好的免疫效果。隨著分子生物學和免疫學技術(shù)的發(fā)展，利用白細胞介素IL-2和IL-4等作為疫苗的免疫佐劑已成為免疫佐劑的研究熱點。本文主要綜述了IL-2和IL-4作為免疫佐劑對病毒保護性抗原基因真核表達的影響，以期為更深入地進行IL-2和IL-4對DNA疫苗增強作用的深入研究提供參考。

1 IL-2和IL-4的生物學作用

白細胞介素作為免疫分子佐劑已經(jīng)在多種傳染性疾病的防治領(lǐng)域得到了廣泛的應用，其中IL-2的應用最為普遍，其次為IL-4。

IL-2是活化的T細胞產(chǎn)生的Th1細胞的特征性因子，雖然其沒有直接的抗病毒活性，但其能刺激T淋巴細胞快速增殖和分化，并產(chǎn)生多種其它細胞因子如IFN-γ，IL-4，IL-S，IL-6，TNF-β及CSF等，對免疫應答具有廣泛的上調(diào)作用。IL-2能夠維護整個NK細胞的活化、分化和增殖，調(diào)節(jié)NK細胞并保持其自然殺傷力；誘導細胞毒性T淋巴細胞產(chǎn)生和增殖；誘導淋巴因子活化淋巴細胞產(chǎn)生；具有促進B淋巴細胞增殖、分化作用；以及協(xié)同其他白細胞介素發(fā)揮作用。

IL-4是活化的T細胞產(chǎn)生的Th2細胞的特征性因子，能夠促進以Th2細胞為特征的免疫應答，增強B細胞介導的體液免疫應答。對于B細胞、T細胞、肥大細胞和巨噬細胞等都有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞的分化、活化；增強抗原遞呈細胞功能；協(xié)助基因疫苗持續(xù)表達高水平特異性抗體。隨著對其免疫調(diào)節(jié)作用研究的深入，發(fā)現(xiàn)IL-4基因與高效表達載體組成重組質(zhì)?？梢蚤L時間持續(xù)表達，增強基因疫苗的免疫原性，提高機體免疫防御能力，有效發(fā)揮佐劑效應。

2 IL-2和IL-4對病毒抗原基因真核表達影響的研究

許多研究發(fā)現(xiàn)：利用細胞因子IL-2和IL-4全基因分別構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒普遍能提高病毒抗原基因真核表達的效果。

陳慧慧[1]等所在實驗室構(gòu)建了CPVVP2、cIL-2和cIL-7真核表達載體，同時利用含內(nèi)部核蛋白進入位點（IRES）的真核表達載體構(gòu)建了cIL-2和cIL-7雙基因表達質(zhì)粒。對4組小鼠分別進行VP2單免疫、VP2+cIL-2、VP2+cIL-7和VP2+cIL-2/cIL-7共免疫，結(jié)果顯示共免疫組小鼠血清的抗體滴度和中和抗體效價均高于VP2單免疫，同時VP2+cIL-2/cIL-7共免疫組顯著高于VP2+cIL-2和VP2+cIL-7共免疫組(P＜0.05 )，表明cIL-2和cIL-7基因?qū)PV VP2 DNA疫苗免疫原性具有明顯的協(xié)同效應。希尼尼根[2]等構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA-IL-2，將pcDNA-IL-2與pcDNA-PRRSVSC2-ORF5共同免疫仔豬。實驗設(shè)pcDNA-IL-2與pcDNA-PRRSVSC2-ORF5共 免 疫 組、pcDNAPRRSV-SC2-ORF5單 免 疫 組、pcDNA3.1（+）空載體和滅菌水免疫組。實驗結(jié)果表明pcDNA-IL-2與pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫組和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫組的IgG含量、CD+和CD+48細胞比例、外周血T淋巴細胞的增殖活性與單免疫組相比均顯著增高。說明豬pcDNA IL-2具有促進體液免疫和細胞免疫功能的作用，能顯著提高pcDNAPRRSV-ORF5基因疫苗的免疫效果。

張建遠[3]等用構(gòu)建的pcDNAPCV-ORF2重組質(zhì)粒與5種細胞因子質(zhì) 粒（IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Y真核表達質(zhì)粒）聯(lián)合對仔豬進行免疫實驗。免疫后通過流式細胞儀測定血液中CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞類的數(shù)量以及間接ELISA法測定豬圓環(huán)病毒II型特異性抗體IgG，結(jié)果顯示CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞類的數(shù)量及特異性抗體IgG均顯著增高，說明細胞因子質(zhì)粒（IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-Y真核表達質(zhì)粒）均可顯著提高DNA疫苗的免疫效果。

貴州大學動物科學學院湯德元[4]等構(gòu)建的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因真核表達質(zhì)粒pcDNA-ORF5和pcDNA-IL-2、pcDNA-IL-4并 免疫仔豬，實驗設(shè)pcDNA-ORF5免疫組、pcDNA-ORF5+pcDNA-IL-2免疫 組、pcDNA-ORF5+pcDNA-IL-4免疫組和pcDNA-ORF5+pcDNAIL-2+pcDNA-IL-4聯(lián)合免疫組。結(jié)果顯示真核表達質(zhì)粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-4可以增強機體對豬繁殖與呼吸綜合征核酸疫苗pcDNAORF5的免疫應答，且pcDNAORF5+pcDNA-IL-2+pcDNA-IL-4聯(lián)合免疫組的免疫增強效果更為顯著。

3 IL-2和IL-4分別與病毒抗原基因構(gòu)建融合真核表達載體的研究

利用IL-2和IL-4分別與抗原基因構(gòu)建的融合雙表達重組質(zhì)粒應用可增強機體對DNA疫苗的免疫應答。

陳創(chuàng)夫等構(gòu)建豬瘟病毒E2基因與IL-2、IL-3基因的真核雙表達載體（pIRST IL-2，pIRST IL-3），并將其分別導入小鼠體內(nèi)，觀察其表達水平，及IL-2、IL-3對DNA疫苗的免疫增強效果。實驗結(jié)果顯示pIRST IL-2、pIRST IL-3所誘導的免疫應答反應比使用單表達質(zhì)粒pIRST強，表明IL-2、IL-3作為基因佐劑能明顯增強豬瘟基因疫苗的免疫效果。肖義蓉[5]等實驗結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pcDNA-IL-2與pcDNAEIII'.VP2共表達組與pcDNA-IL2-EIII'.VP2融合表達組JEV/PPV抗體水平明顯高于空載體對照組，說明IL-2重組質(zhì)粒能顯著增強核酸疫苗免疫原性，其中融合基因形式構(gòu)建的真核質(zhì)粒pcDNA-IL2-EIII'.VP2免疫增強效果更明顯。徐凱等將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCI-IL-2-ORF2'-VP2免疫BALA/c鼠，同時設(shè)立豬細小病毒滅活苗組、豬圓環(huán)病毒亞單位苗組和pCI空載體對照組，以檢測免疫小鼠脾臟淋巴細胞的轉(zhuǎn)化功能，外周血T淋巴細胞亞群的動態(tài)變化及血清PCV2、PPV抗體效價。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pCI-IL-2-ORF2'-VP2二免后小鼠均產(chǎn)生良好的免疫應答，其中脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能，CD4+、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量和血清PPV/PCV2抗體的OD值均高于或顯著高于其他3組。表明豬IL-2作為基因佐劑能顯著增強VP2/ORF2'核酸疫苗誘導的免疫應答。

貴州大學動物科學學院湯德元、王洪光[6]等將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-gE1，pcDNA3.1(+)-IL-2，pcDNA3.1(+)-gE2-IL-2分別免疫小鼠和仔豬，實驗設(shè)pcDNA3.1(+)-gE1免 疫 組，pcDNA3.1(+)-IL-2免 疫 組，pcDNA3. 1(+)-gE1和pcDNA3.1(+)-IL-2聯(lián)合免疫組，pcDNA3.(+)-gE2-IL- 2融合蛋白免疫組，空載體組和生理鹽水組。結(jié)果顯示聯(lián)合免疫組及融合蛋白免疫組小鼠和仔豬血清抗體效價均高于其他實驗組，同時聯(lián)合免疫高于融合蛋白免疫組，但差異不顯著，說明聯(lián)合免疫組及融合蛋白免疫組均能一定程度誘導小鼠和仔豬產(chǎn)生體液免疫；聯(lián)合免疫組及融合蛋白免疫組小鼠和仔豬CD4+、CD8+、CD4+CD8+淋巴細胞水平均顯著高于其他實驗組，同時聯(lián)合免疫組顯著高于融合蛋白免疫組，說明聯(lián)合免疫組及融合蛋白免疫組誘導小鼠和仔豬產(chǎn)生細胞免疫，但效果不顯著。

細胞因子IL-2和IL-4真核表達質(zhì)粒與病毒抗原基因構(gòu)建的真核表達載體聯(lián)合免疫動物、細胞因子IL-2和IL-4與病毒抗原基因構(gòu)建的融合雙表達重組質(zhì)粒免疫動物，兩者都能增強真核表達的效果，但關(guān)于兩者之間免疫效果的比較研究沒有得到一致結(jié)論，也有許多實驗表明：并非所有融合蛋白都發(fā)揮出其預想的協(xié)同效應，這可能是由于相連的兩種分子在肽鏈折疊過程中相互干擾，不能形成天然空間構(gòu)型，從而影響了其生物學活性有關(guān)，由此可見，無論是細胞因子IL-2和IL-4真核表達質(zhì)粒與病毒抗原基因構(gòu)建的真核表達載體聯(lián)合免疫動物或者是細胞因子IL-2和IL-4與病毒抗原基因構(gòu)建的融合雙表達重組質(zhì)粒免疫動物，其免疫效果，都有待于進一步深入研究。

細胞因子用作免疫佐劑誘導基因疫苗發(fā)揮更有效的免疫作用是未來基因疫苗發(fā)展的趨勢，相信隨著分子免疫學和疫苗研究等相關(guān)學科迅速發(fā)展，利用細胞因子作為免疫佐劑疫苗的免疫開發(fā)研究會克服重重困難取得預期的效果。

[1] 陳慧慧. IL-2與IL-7基因?qū)θ毿〔《綱P2DNA疫苗的協(xié)同免疫增強作用[D].河北農(nóng)業(yè) 大學，2013.

[2] 希尼尼根，程安春，汪銘書，等. 豬IL-2真核表達質(zhì)粒構(gòu)建及對PRRSVORF5基因疫苗免疫佐劑作用的研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2007（9）：1003-1008.

[3] 張建遠，王紅寧，陳錦銳，等. 豬圓環(huán)病毒核酸疫苗pcDNA-PCV-ORF2-ISS的構(gòu)建及分子佐劑聯(lián)合免疫研究[J].中國獸醫(yī)學報，2009，12：1511-1515.

[4] Deyuan Tang， Jian Liu， Chunyan Li， et al.Positive effects of porcine IL-2 and IL-4 on virus- specific immune responses induced by the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) ORF5 DNA vaccine in swine[J]. Vet Sci. Mar 2014，15(1)：99-109.

[5] 肖義蓉，王印，郭萬柱，等. 豬IL-2對pcDNA-E39.VP2真核共表達質(zhì)粒免疫原性的影響[J].中國獸醫(yī)學報，2011，31（7）：937-941.

[6] 王洪光，郝飛，湯德元，等. 偽狂犬病病毒gE基因DNA疫苗在動物體內(nèi)誘導的免疫應答及IL-2對其作用影響[J].畜牧獸醫(yī)學報，2014，45(9)：1488-1496.