靈芝多糖的研究進(jìn)展

趙 巖 張 瑩 初 樂(lè) 和法濤 葛邦國(guó) 宋 燁

（1.中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省輕工業(yè)設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250014）

靈芝（Ganoderma lucidum）又稱靈芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株。按本草綱目記載“靈芝性平，味苦，無(wú)毒，主胸中結(jié)，益心氣，補(bǔ)中，增智慧，不忘，久服輕身不老，延年神仙”。靈芝中通常含有多種活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)和氨基酸、碳水化合物（主要為多糖）、脂肪和三萜類化合物、維生素和礦物質(zhì)等[1]，具有很高的藥用價(jià)值。靈芝多糖（Ganoderma Lucidum polysaccharides，GLP）是其中主要的一類活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老以及調(diào)節(jié)血糖等生理功能，是目前靈芝研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)[2]。本文就近年來(lái)靈芝多糖的制備、測(cè)定方法、結(jié)構(gòu)分析以及生物活性研究的新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 靈芝多糖的提取與分離純化

傳統(tǒng)的靈芝多糖提取方法多為熱水浸提。利用多糖溶于熱水而不溶于醇、醚、丙酮等有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，從靈芝中進(jìn)行提取。大致的工藝流程為：子實(shí)體粉碎→醇提→熱水回流→減壓濃縮→離心→醇沉→干燥[3]。目前對(duì)于靈芝多糖的制備過(guò)程的研究主要包括提取方法（包括原料的預(yù)處理）、分離純化和純度鑒定。

1.1 靈芝多糖的提取

在靈芝多糖的提取過(guò)程中，多糖含量受到很多因素的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選，優(yōu)化后工藝為：料液比1:30，提取時(shí)間3h，提取溫度100℃，碳酸鈉鹽濃度0.5%。靈芝多糖得率由傳統(tǒng)工藝1.027%提高至2.825%[4]。由于傳統(tǒng)工藝存在提取時(shí)間長(zhǎng)，得率低的問(wèn)題，許多研究工作者開展微波輔助、超聲波輔助萃取靈芝多糖的研究工作。超聲波法提取率是索氏法的1.23倍，提取時(shí)間比索氏法縮短9倍；微波法提取率是索氏法的1.69倍，提取時(shí)間比索氏法縮短45倍[5]。顧丹健等[6]采用真空微波預(yù)處理法與傳統(tǒng)熱水提法比較，得出料液比、提取溫度相同的情況下，真空微波預(yù)處理法在提取時(shí)間縮短一半的基礎(chǔ)上，提取得率提高40.8%。與常規(guī)熱水提取法相比，微波輔助提取法具有高效、節(jié)能、省時(shí)的特點(diǎn)[7]。超聲波輔助提取中各因素對(duì)靈芝多糖得率的影響由大到小依次為：超聲功率>料液比>提取溫度>超聲時(shí)間，靈芝多糖的最佳提取工藝為：超聲功率500W，提取溫度45℃，超聲時(shí)間35min，料液比l:25，靈芝多糖的得率為2.75%[8]。酶解可提高多糖得率，添加1.5%纖維素酶（相對(duì)于底物），將優(yōu)化后的酶法提取結(jié)果與傳統(tǒng)熱水浸提法進(jìn)行比較，靈芝多糖的回收率提高19.5%[9]。

1.2 靈芝多糖的分離純化方法

靈芝子實(shí)體、菌絲體制成的提取液中多糖濃度一般較低，需要濃縮，濃縮工藝有常壓蒸餾、減壓蒸餾、超濾等。絕大部分多糖在常規(guī)有機(jī)溶劑中具有較小的溶解度，所以一般采用有機(jī)溶劑將濃縮液中的多糖沉淀下來(lái)。一般將pH調(diào)至7.0左右，采用乙醇和丙酮，進(jìn)行反復(fù)溶解和醇沉，可以得到部分粗多糖[10]。多糖的分離也可用季銨鹽沉淀法、超濾法、酸法、Ca(OH)2沉淀法等。多糖的傳統(tǒng)分離方法一般采用醇沉法，先將靈芝水提液進(jìn)行一定程度地濃縮，按照濃縮后溶液的量加入3~4倍體積的乙醇，低溫存放靜置24h后，通過(guò)過(guò)濾冼滌可以得到粗多糖[11]；季銨鹽沉淀法要求溶液中多糖濃度在0.1~1%為宜，過(guò)高，沉淀過(guò)程中易吸留雜質(zhì)，同時(shí)濃縮成本增加；過(guò)低，微量沉淀難于回收。季銨鹽沉淀法雖然分離效率高，但價(jià)格高，多糖溶液需要濃縮，沉淀多糖中殘留的季銨鹽也需除去[12]；張寧等[13]采用了中空纖維超濾設(shè)備來(lái)對(duì)富含游離在微生物細(xì)胞外的Ps-9415發(fā)酵液進(jìn)行多糖的濃縮分離，超濾膜的截留分子量為50000，研究結(jié)果表明，料液濃度、溫度、操作壓力對(duì)膜通量具有明顯影響，在較高的操作壓力下，高溫、低濃度的料液通量較大。中空纖維超濾設(shè)備具有截留效果好，通量高，濃縮充分等優(yōu)點(diǎn)[14]。這種方法可以去除多糖提取液中的小分子物質(zhì)。將另一組提取液作對(duì)照組進(jìn)行透析法處理，在對(duì)原液濃度、操作壓力等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，得到的樣品多糖得率和含量都高于對(duì)照組。

從靈芝子實(shí)體中提取的粗多糖除雜質(zhì)后在作為藥物或多糖結(jié)構(gòu)研究時(shí)，需要進(jìn)行脫蛋白質(zhì)，常用的主要有Sevag法、三氯乙酸法、三氟三氧乙烷法以及酶法結(jié)合，目前正逐漸被更簡(jiǎn)便、處理效果更好的蛋白酶與Sevag結(jié)合法以及三氯乙酸法所替代[15]。用活性炭吸附、20%過(guò)氧化氫溶液即可除去靈芝多糖中色素，但采用活性炭吸附法耗時(shí)長(zhǎng)，多糖損失量大，采用雙氧水氧化法可能破壞多糖的生物活性。曹鵬偉等[16]研究了D392陰離子交換樹脂對(duì)色素靜態(tài)吸附行為和熱力學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)色素的吸附等溫線更符合Freundlich模型，為這一方法實(shí)際應(yīng)用提供參考。通過(guò)透析法、超濾或納濾得方法可以除去粗多糖中的低聚糖、無(wú)機(jī)鹽、小分子游離蛋白和色素等雜質(zhì)。

2 靈芝多糖的分析方法

靈芝多糖分級(jí)純度鑒定的方法也比較多，有電泳法（濾紙電泳、玻璃纖維紙電泳、醋酸纖維膜電泳、聚丙烯酞胺凝膠電泳等）、超離心法、高效凝膠滲透色譜法、層析法（紙層析、葡聚糖凝膠柱層析等）等[17]。多糖物理性質(zhì)的測(cè)定，如多糖分子量、溶解度、旋光性、粘度等，也影響著方法的選擇。分子量測(cè)定一般采用凝膠滲透色譜法，多糖相對(duì)于蛋白質(zhì)和核酸，其具有復(fù)雜的一級(jí)結(jié)構(gòu)。早期利用化學(xué)分析法研究多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)，主要采用完全酸水解法、Smith降解、甲基化法、酸或堿部分降解法、高碘酸氧化法等[18]。但由于藥品消耗大、操作繁瑣，逐漸采用儀器分析來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法。目前主要的儀器分析方法有：氣相色譜法、高效液相色譜法、質(zhì)譜分析法、核磁共振法、紅外光譜法等諸多方法。對(duì)于多糖更為復(fù)雜的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，目前采用的研究方法有：X射線衍射、旋光譜和圓二色譜、13C-NMR及ZD-NMR、快原子轟擊質(zhì)譜、色質(zhì)聯(lián)用、酶技術(shù)-NMR等[19]。

3 靈芝多糖的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

羅立新等[20]從靈芝菌絲體和子實(shí)體水提液中分離純化出兩種多糖，采用凝膠濾過(guò)色譜得到這兩種多糖的分子量分別為3.7× 104Da和4.2× 104Da。氣相色譜結(jié)果測(cè)得，菌絲體多糖含D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳塘、L-巖藻糖、D-木糖、L-鼠李糖，其摩爾質(zhì)量比為5.35:1.00:2.67:0.38:1.19:0.37；子實(shí)體多糖中D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-木糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖，其摩爾比為5.82:1.00:2.23: 0.72:0.51:1.35。分別采用IR、13C-NMR等手段對(duì)靈芝多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，確定兩種多糖都是以β-(1→3)糖苷鍵為主鏈的雜多糖，在6-O和4-O上有分支，兩者分支的類型和數(shù)目有所不同。Qian等[21]用高效液相分析出靈芝多糖由5種單糖和二糖組成，包括木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，其分子含量比分別是為0.4%:14.4%:12.8%:0.7%:50.9%。Ye等[22]對(duì)多糖的組分做了更深入系統(tǒng)的研究。采用三氟乙酸對(duì)存在于靈芝子實(shí)體中的水溶性多糖進(jìn)行水解，用高效液相色譜法測(cè)得多糖分子的分子量為12000Da。利用陰離子交換層析來(lái)確定其單糖成分，測(cè)得葡萄糖：巖藻糖：半乳糖的摩爾比為1.00:1.09:4.09。Huang等[23]從靈芝子實(shí)體中分離得到一水溶性靈芝多糖，采DEAE凝膠柱和丙烯葡聚糖凝膠S-500HR分離純化，中性多糖平均分子量約為2.5×106kDa。采用GC分析該多糖主要有葡萄糖和半乳糖構(gòu)成，質(zhì)量比為34:1。應(yīng)用1H and 13C NMR 串聯(lián) GC–MS分析，該多糖是由1,4-雙取代-β-葡萄吡喃糖和1,4,6-三取代-β-葡萄吡喃糖，支鏈主要由 1,6-二取代-β-葡萄吡喃糖和1,4-雙取代-β-半乳鼠李糖。

從上述內(nèi)容可以看出，靈芝子實(shí)體多糖種類繁多，分別為水溶性多糖、酸性多糖和堿性多糖。大部分多糖以α-(1→6)或β-(1→3) (1→6)及(1→4)為主鏈，其側(cè)鏈種類結(jié)構(gòu)大不相同，組分多樣。靈芝多糖主要為雜多糖，包含D-巖藻糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖。

4 靈芝多糖的功能研究

4.1 抗氧化作用

生物體在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)對(duì)體內(nèi)脂類、蛋白質(zhì)、核酸、糖類等造成的氧化損害是引發(fā)炎癥、心腦血管疾病、心臟疾病的重要因素，因此高效的抗氧化劑對(duì)健康具有重要意義。Chen等[24]研究了靈芝多糖對(duì)患宮頸癌的大鼠的血清中抗氧化酶和免疫反應(yīng)的影響，抗氧化反應(yīng)效果是通過(guò)測(cè)定DPPH自由基、氧自由基、氫氧根自由基的含量，結(jié)果表明靈芝多糖能有效提高對(duì)上述自由基的清除能力。Xu等[25]對(duì)靈芝多糖進(jìn)行了羧甲基化，分別測(cè)定了水溶性、化學(xué)性質(zhì)和體外的抗氧化活性，重點(diǎn)研究了其清除羥自由基（5mg/mL達(dá)83.7%）和過(guò)氧化氫（10mg/mL達(dá)51.6%）的能力，證明羧甲基化的靈芝多糖有更高的抗氧化活性，認(rèn)為羧甲基化后的靈芝多糖可作為食品和藥物制劑中作用突出抗氧化物質(zhì)。Jia等[26]以威斯塔成年雄性大鼠通過(guò)注射鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病，注射溶解于15% DMSO的靈芝多糖，時(shí)間為30d，結(jié)果測(cè)得大鼠注射過(guò)靈芝多糖后，體內(nèi)胰島素量、抗氧化酶量升高，脂質(zhì)過(guò)氧化和血糖含量有所下降，認(rèn)為靈芝多糖有明顯的抗氧化性。Xie等[27]通過(guò)研究靈芝多糖在皮膚衰老基因表達(dá)水平，分析了其抗衰老作用的機(jī)制，在角蛋白細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中用靈芝多糖處理，結(jié)果在總量18346個(gè)人基因中，103個(gè)基因的表達(dá)受到了增量調(diào)節(jié)，從而證實(shí)了靈芝多糖能誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌進(jìn)而提高有絲分裂和細(xì)胞增長(zhǎng)的能力。

4.2 免疫調(diào)節(jié)作用

現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝多糖具有免疫增強(qiáng)作用。Yue等[28]比較了靈芝不同部位所含的多糖種類和活性，分別驗(yàn)證了在患有S-180肉瘤的小鼠體內(nèi)，靈芝子實(shí)體不同結(jié)構(gòu)（整個(gè)子實(shí)體，菌蓋和菌柄）以及靈芝孢子（孢肇破損和未破損的）的抗腫瘤作用和免疫活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靈芝整個(gè)子實(shí)體提取物及破壁靈芝孢子相比菌蓋提取物對(duì)肉瘤的抑制作用更為明顯。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)靈芝熱水提取物及靈芝孢子在免疫刺激活性方面的效果差別不大。江振友等[29]研究觀察靈芝多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、NK細(xì)胞活性、DTH、碳廓清試驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)的影響，蛄果提示靈芝多糖能提高小鼠的非特異性爭(zhēng)特異性細(xì)胞免疫功能。Ma等[30]通過(guò)研究證實(shí)了靈芝孢子的多糖提取物能刺激脾單核細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌，從而體現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)活性。研究發(fā)現(xiàn)在靈芝孢子多糖處理的脾單核細(xì)胞中，可調(diào)控肌球蛋白輕鏈2-A，GDP-解離抑制因子B、T細(xì)胞特異性GTP酶、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白僅的表達(dá)增加。

4.3 其他作用

靈芝多糖的生物活性種類較多，除主要的免疫調(diào)節(jié)及抗氧化作用外還有抗腫瘤及抗輻射等功能。Nonak等[31]給接種MM46乳腺內(nèi)瘤C3H/H的小鼠飼喂含2.5%鹿角靈芝粉（AF）的飼料，可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，且延長(zhǎng)了生存期；給接種S-180的ddy小鼠灌服AF后取得了類似的結(jié)果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，AF可防止接種MM46乳腺內(nèi)瘤C3H/H小鼠局部淋巴結(jié)中IFNγ產(chǎn)生減少，而靈芝多糖卻可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫的機(jī)制誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ，結(jié)果都是令I(lǐng)FNγ增加，由此可推出，免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤機(jī)制有一定聯(lián)系。Pillai等[32]通過(guò)小鼠的生存率、網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)微核的誘導(dǎo)、質(zhì)粒pBR322DNA的絲條斷裂和制止過(guò)氧化作用抑制等試驗(yàn)來(lái)研究靈芝多糖在體內(nèi)外的防輻作用。

5 展望

近幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)科技人員對(duì)靈芝多糖的提取分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定和保健功能等方面進(jìn)行了大量的工作，并取得了不少可喜的成果，關(guān)于生物活性于構(gòu)效關(guān)系方面也開始進(jìn)行深入的研究。但同時(shí)我們也應(yīng)當(dāng)看到：一些實(shí)驗(yàn)研究成果與實(shí)際應(yīng)用還存在一定的距離。一些提取、分離手段還僅局限在實(shí)驗(yàn)室，不能用于工業(yè)生產(chǎn)。目前國(guó)內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)仍以傳統(tǒng)工藝水提醇沉制備粗多糖為主，而高附加值的針劑產(chǎn)品較少。由于靈芝多糖的復(fù)雜性以及分離和分析方法的種種限制，靈芝多糖的種類至今尚未探明，其分子結(jié)構(gòu)也未完全確定隨著分離，純化技術(shù)的不斷創(chuàng)新，構(gòu)效關(guān)系的不斷深入，靈芝多糖會(huì)在更廣闊的領(lǐng)域具有更廣泛的發(fā)展前景。

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