止汗外用凝膠中姜黃素的定性與定量研究

劉 嘉，趙慶年，劉漢清

0 引言

止汗外用凝膠是由郁金、石菖蒲、麻黃根等中藥組方而成的治療自汗、盜汗的外用制劑，臨床療效明確。然而，與多數(shù)外用中藥制劑一樣，止汗外用凝膠制備工藝傳統(tǒng)，未對主要有效成分建立精確的含量測定方法，因此，其質(zhì)量控制尚不完善。姜黃素(curcumin)為止汗外用凝膠劑中的主要成分，具有破血行氣，通經(jīng)止痛之功效。藥理學研究證實，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等諸多藥理作用[1]。而近年來，姜黃素更是被認為在治療涉及炎癥反應(yīng)的各種創(chuàng)傷性疾病中有廣闊的應(yīng)用前景[2]。本研究應(yīng)用TLC法定性鑒別止汗外用凝膠中的姜黃素，并采用HPLC法測定制劑中姜黃素的含量，以期為止汗外用凝膠質(zhì)量標準的完善提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100高效液相色譜儀，DAD紫外檢測器(美國安捷倫公司)；KQ-250B型超聲波振蕩器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)；WD-9403B型紫外儀(北京六一儀器廠)；薄層硅膠G板(青島海洋化工廠)。姜黃素對照品(批號：1215-9708，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所)；郁金對照藥材(購自江蘇省藥材公司，經(jīng)江蘇建康職業(yè)學院趙慶年副教授鑒定)；止汗外用凝膠(自制，規(guī)格：10 g/支，批號：121113、121127、121217)。乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素的TLC鑒別[3]①對照品溶液的配制：取姜黃素對照品0.2 mg，加入甲醇2 mL，溶解即得。②供試液、陰性制劑對照液及陽性藥材對照液的配制：取止汗外用凝膠供試品、不含郁金的按制劑制備工藝制備成的陰性制劑供試品各10 g，郁金對照藥材1 g，分別加入無水乙醇60 mL，水浴回流至提取液無色時，濾過，濾液分別濃縮至40 mL，濾過，分別制得。③點樣、展開：取薄層硅膠G板先以10%的甲酰胺-丙酮溶液展開1次，取出，晾干備用。取上述陰性制劑對照液、供試液、陽性藥材對照液及對照品溶液及各10 μL，分別點樣于上述處理過的硅膠G板上，以氯仿∶甲醇∶甲酸(96∶4∶0.6)為展開劑，展開，取出，晾干。④結(jié)果：在365 nm紫外燈下檢視，供試品薄層色譜與姜黃素對照品及陽性藥材對照品薄層色譜在相同位置顯亮黃色斑點(見圖1)。

圖1 姜黃素的TLC鑒別圖譜

2.2 姜黃素的含量測定

2.2.1 色譜條件 Ecosil ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶水∶冰醋酸(45∶55∶6)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液配制 ①對照品溶液：精密稱取姜黃素對照品適量，加甲醇配成0.2 mg/min的對照品溶液。②供試液：精密稱取樣品10 g，用10倍量甲醇浸泡2 h后，超聲提取3 h，離心，取出上清液。藥渣同前處理2次。合并3次提取液，適當濃縮，以甲醇定容至10 mL，0.45 μm濾膜濾過，即得。③陰性對照液：根據(jù)處方及相應(yīng)工藝制備缺郁金的陰性制劑樣品，按供試液的配制方法配制即得。

2.2.3 檢測波長選擇 取姜黃素對照液以適量的流動相稀釋后，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果其在254 nm處有最大吸收，故確定254 nm為檢測波長。

2.2.4 專屬性試驗 取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各20 μL，按“2.2.1”項下的色譜條件進樣、測定。結(jié)果顯示，姜黃素的色譜峰峰型良好，保留時間約8 min，與其他色譜峰分離良好。在陰性對照液的色譜圖中，姜黃素相應(yīng)的保留時間處無色譜峰，說明陰性供試液無干擾，見圖2。

圖2 姜黃素的含量測定色譜圖

2.2.5 標準曲線 精密稱取姜黃素對照品適量，加甲醇配成0.1、0.2、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/min的對照品溶液，分別進樣20 μL，按“2.2.1”項下的色譜條件測定，以姜黃素的濃度(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，計算得到線性回歸方程：Y=329 786X-106 402，r=0.999 4。結(jié)果表明，姜黃素在0.1～0.8 mg/min的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度、重復性及穩(wěn)定性試驗 精密吸取濃度為0.2 mg/min的對照品溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件，重復進樣5次，RSD為0.75%(n=5)，表明儀器精密度良好。精密吸取濃度為0.2 mg/min的對照品溶液5份，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣測定，RSD為1.42%(n=5)，表明方法重復性良好。取同一供試液(批號：121113)，按“2.2.1”項下的色譜條件，于1、2、3、4、5 h分別進樣測定，結(jié)果RSD為1.54%(n=5)。表明5 h內(nèi)供試液穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的姜黃素樣品適量，分別精密加入0.2 mg姜黃素對照品，按上述的方法處理并測定。姜黃素加樣回收率=(測得量-原樣品含量)/加入量。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=5)

2.2.8 樣品測定 取本組3個批號的樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試液，按“2.2.1”項下色譜條件測定姜黃素的含量，結(jié)果見表2。

表2 止汗外用凝膠樣品中姜黃素的含量測定結(jié)果

3 討論

在TLC定性鑒別中，我們以無水乙醇為提取溶劑，水浴回流法提取止汗外用凝膠供試品中的姜黃素；而在HPLC含量測定時，我們則以甲醇為溶劑，采用超聲法提取制劑中的姜黃素。提取溶劑選擇不同的原因為：在薄層鑒別中，采用溶解范圍更廣的無水乙醇能提取出制劑樣品中更多的相關(guān)成分，使得薄層色譜更易對比識別。而在HPLC測定時，如使用無水乙醇為提取溶劑，則會導致提取的成分過多而干擾姜黃素的測定，故選擇甲醇為提取溶劑。另外，根據(jù)周燕霞等[4]對郁金中姜黃素的提取方法選擇的報道及預實驗的結(jié)果，我們選擇了以10倍量甲醇浸泡2 h，超聲3 h共提取3次的操作。該法姜黃素得率較普通回流法高，且時間較短、簡單易行，值得借鑒。

本研究的液相條件是在2010版藥典的基礎(chǔ)上，結(jié)合預實驗結(jié)果摸索而出。在先期選擇HPLC的流動相時，分別考察了甲醇-水及乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果顯示，以甲醇-水為流動相可使樣品中姜黃素的色譜峰不能與相鄰雜質(zhì)峰較好分離；而乙腈-水系統(tǒng)則存在一定的拖尾現(xiàn)象，在加入掃尾劑冰醋酸后，樣品中的姜黃素峰型良好，并能與雜質(zhì)峰較好地分離。另外，相關(guān)文獻報道，姜黃素在中性條件下的穩(wěn)定性較差[5]，而在進行HPLC的穩(wěn)定性研究時，我們亦發(fā)現(xiàn)，在5 h內(nèi)供試液穩(wěn)定性良好，而在10 h供試液中姜黃素濃度下降10%左右，這提示在進行姜黃素的定性鑒別及含量測定時，應(yīng)及時進樣、現(xiàn)配現(xiàn)用，以免因穩(wěn)定性下降而導致的測量結(jié)果不準確。

綜上所述，TLC法定性鑒別和HPLC法定量測定止汗外用凝膠中姜黃素，方法可行，重現(xiàn)性好，為止汗外用凝膠的質(zhì)量控制提供了可靠依據(jù)。

參考文獻：

[1] 李琦,金劍,許穎.姜黃素的藥理作用及其臨床應(yīng)用進展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,21(12):1366-1368.

[2] 涂燕華,孫連娜.姜黃素與類風濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)實驗研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(19):310-314.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:247.

[4] 周燕霞,唐明林,李元波,等.郁金中姜黃素提取工藝研究[J].廣州化學,2006,31(2):34-38.

[5] 韓剛,崔靜靜,畢瑞,等.姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素穩(wěn)定性研究[J].中國中藥雜志,2008,33(22):2611-2614.