JNK蛋白在白藜蘆醇抗心肌缺血再灌注損傷中作用

王 冰，于 明，武 岳，李 川，姚天明

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016

中藥虎杖為蓼科蓼屬多年生草本植物虎杖的干燥根和莖，葉亦入藥。其性味苦寒，歸肝、肺、膽經(jīng)。主要功效為祛風利濕，祛痰止咳，清熱解毒，活血化瘀。其主要有效成分白黎蘆醇具有擴血管、抗血栓、抗休克、降血脂及抗氧化等作用。實驗研究表明，白藜蘆醇預(yù)處理能明顯減輕大鼠腦缺血引起的腦損傷[1]。隨著對白藜蘆醇的不斷研究，其保護作用也進一步擴大。有文獻報道，其對腎臟、肝臟、腸、視網(wǎng)膜以及肢體等器官和組織的缺血再灌注都有保護作用[2-6]。本研究通過制作離體大鼠心肌缺血再灌注模型，并給予白藜蘆醇預(yù)處理，觀察白藜蘆醇對缺血再灌注心肌的保護作用并研究其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年SD大鼠36只，體重200～250 g，雄性，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物中心提供。

1.2 藥品試劑 白藜蘆醇注射液(河南海鑫動物藥業(yè))， 肌酶激酶(CK)(A032)、乳酸脫氫酶(LDH)(A020)、超氧化物歧化酶(SOD)(A001)和丙二醛(MDA)(A003)。試劑盒均由南京建成生物工程研究所購得，肝素鈉注射液。

1.3 方法

1.3.1 離體心臟灌流液 改良的Krebs-Henseleit(K-H)液，主要成分為(單位：mmol/L):NaCl 118.9，KCl 4.7，CaCl22.2，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO317.9，EDTA 0.03，Glucose 10，超純水配制。

1.3.2 模型制作 用3%戊巴比妥鈉 (0.1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后將大鼠背位固定，切開腹腔，下腔靜脈注入3%濃肝素(0.1 ml/100 g)以防血栓形成。迅速開胸剪去胸廓，顯露心臟及大血管，剪斷肺靜脈。迅速取出心臟，放入預(yù)冷(4 ℃)的改良K-H液中，排出心腔內(nèi)殘余血液，經(jīng)主動脈逆行插管并結(jié)扎，懸掛于Langendorff裝置上。另將球囊測壓管經(jīng)左心耳通過二尖瓣插入左心室，經(jīng)換能器連在多導(dǎo)生理記錄儀上，調(diào)節(jié)左心室內(nèi)球囊的容積使左心室的舒張末期壓力為7～9 mmHg。將心臟置于37 ℃保溫灌流室內(nèi)，于 Langendorff心臟灌流裝置主動脈逆行灌注K-H緩沖液，以沖洗殘留于心臟的血液，灌流液恒溫(37 ℃)，恒壓(60 mmHg)，并為100% O2飽和。平衡灌注15 min后，停灌(阻斷主動脈灌注管，缺血)30 min，隨后恢復(fù)灌注40 min。

1.3.3 分組及用藥 隨機將36只大鼠分成3組：對照組、缺血再灌注組和白藜蘆醇組。對照組：正常K-H液灌流85 min；缺血再灌注組：K-H液預(yù)灌流15 min，停灌30 min， 再灌注40 min；白藜蘆醇組：先灌注含藥物15 mg/L的K-H液15 min，停灌30 min，再灌注40 min。

1.3.4 心功能指標測定 利用多導(dǎo)生理記錄儀分別測量各組缺血前、復(fù)灌20 min、復(fù)灌40 min時心功能指標：心率(HR)、左室舒張壓(LVDP)、左室舒張末壓(LVEDP)、心室內(nèi)壓最大變化速率(±dp/dtmax )。

1.3.5 LDH和CK檢測 分段收集流出液(缺血前、復(fù)灌20 min、復(fù)灌40 min)，按試劑盒說明書，采用比色法測定LDH和CK活性。

1.3.6 心肌梗死體積檢測 實驗結(jié)束時，每組從剩余大鼠中再隨機選取6只，經(jīng)主動脈逆行灌注0.5%伊文思藍2～3 ml。心臟稱重后，放于- 80 ℃冰箱中凍存，30 min后將心臟沿長軸均勻切為6～9片，并浸泡于pH 值為7.4、濃度為10 g/L 的TTC磷酸緩沖液中，于37 ℃水箱孵化20 min，染色，后置于10%福爾馬林固定，取出后可觀察到缺血危險區(qū)為紅色，梗死區(qū)為白色。在圖像分析軟件(Sigma Scan program 4)下計算出缺血危險區(qū)(AAR)和梗死區(qū)(IS)的體積，心肌梗死體積以IS/AAR來表示。1.3.7 JNK水平檢測 取出剩余心臟，置于冰屑上，剪取左心室全部心肌組織，心肌組織加入4倍體積細胞裂解液，研磨和超聲裂解并離心，收集上清液，考馬斯亮藍法進行蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE分離樣品后電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，TBS-T液室溫封閉1 h 后，加入一抗(抗磷酸化JNK的兔多克隆抗體或抗JNK的兔多克隆抗體)，室溫下免疫沉淀1 h，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下作用2 h。洗膜，顯色。采用Quantity one圖像分析軟件分析掃描條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組心功能指標檢測結(jié)果(表1) 與對照組相比，缺血再灌注組大鼠在心肌缺血時HR降低，LVDP以及±dp/dtmax下降，LVEDP則升高(P<0.05)。在再灌注期間，上述指標雖可逐漸恢復(fù)，但仍未能達到心臟缺血前水平，說明離體心臟缺血再灌注模型建立成功。與缺血再灌注組相比，白藜蘆醇組大鼠心肌再灌注20、40 min的HR變快，LVDP和±dp/dtmax明顯上升，而LVEDP則明顯下降(P<0.05)。表明白藜蘆醇對缺血再灌注心臟功能有明顯的保護作用。

2.2 心肌LDH、CK檢測(表2) 在缺血再灌注過程中，心肌細胞內(nèi)的CK、LDH漏出增加，與缺血前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。白藜蘆醇治療組再灌注20、40 min的CK、LDH與缺血組相比，CK、LDH漏出明顯減少(P<0.05)。

表1 3組心功能指標測量結(jié)果±s，n=6)

注：對照組與缺血再灌注組缺血前相比，aP<0.05；白藜蘆醇組與缺血再灌注組相比，bP<0.05。

表2 白藜蘆醇對離體缺血再灌注大鼠心肌CK和LDH的影響±s，n=6)

注：對照組與缺血再灌注組缺血前相比，aP<0.05；白藜蘆醇組與缺血再灌注組相比，bP<0.05。

2.3 心肌梗死體積檢測結(jié)果(表3) 與缺血再灌注組相比，白藜蘆醇治療組的AAR由(0.473±0.087)cm3下降到(0.343±0.112)cm3，而IS/AAR的數(shù)值則從(49.323±14.002)降低到(30.021±9.834)，P<0.05。表明白藜蘆醇使缺血再灌注心肌損傷減輕，縮小梗死體積。

表3 白藜蘆醇對離體缺血再灌注大鼠心肌梗死 體積的影響±s，n=6)

注：白藜蘆醇組與缺血再灌注組相比，aP<0.05。

2.4 心肌JNK水平檢測結(jié)果(圖1) 與對照組相比，缺血再灌注組和白藜蘆醇組心肌組織中JNK的總量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。缺血再灌注過程中，心肌組織中JNK的磷酸化水平明顯升高，而白藜蘆醇治療組可以使JNK的磷酸化水平明顯恢復(fù)(P<0.05)，但不能達到正常水平。

注： 缺血再灌注組與對照組相比，aP<0.05；白藜蘆醇組與>缺血再灌注組相比，bP<0.05。

圖1 白藜蘆醇對離體缺血再灌注大鼠JNK的影響

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷過程中，再灌注引發(fā)的氧自由基增多及Ca2+超載可能損傷細胞結(jié)構(gòu)及細胞功能，使細胞能量代謝障礙，細胞膜通透性增加，并最終引起心肌細胞損傷，終末期各種代謝物質(zhì)釋放入血[7]。因此，血清CK和LDH活性及心功能的測定可作為觀察心肌缺血再灌注損傷程度及藥物療效和預(yù)后的指標[8]。白藜蘆醇屬于植物酚類，是天然的抗氧化物以及自由基清除劑，主要存在于各種紅葡萄果實中，具有廣泛的生理藥理作用，對其作用機制的研究也越來越廣泛[9]。本研究首先通過制作心肌缺血模型，在器官水平通過檢測心肌酶譜以及心肌梗死體積觀察白藜蘆醇的心肌保護作用，進而研究其可能作用的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進一步闡明、豐富白藜蘆醇的保護作用分子機制。

JNK細胞蛋白屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的成員，是進化上偏于保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[10，11]。以JNK信號蛋白為中心的JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可被細胞因子、生長因子以及物理刺激等多種因素激活[12，13]?；钚匝蹩梢酝ㄟ^影響激酶本身和激酶抑制物的活性激活JNK信號通路[14，15]。JNK蛋白自身包括磷酸化以及非磷酸化兩種形式，磷酸化水平?jīng)Q定其活性，包含雙磷酸化功能區(qū)Thr-Pro-Tyr與c-Jun氨基末端的活化區(qū)結(jié)合并使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化。有報道，肝星狀細胞被乙醛處理后JNK的磷酸化水平升高[16，17]。抑制JNK途徑可發(fā)揮保護老年大鼠缺血再灌注后的神經(jīng)元損傷等作用[18]，抑制JNK途徑能明顯改善大鼠心肌梗死體積及缺血再灌注的心臟收縮功能，提示JNK途徑參與了缺血心肌的保護作用[19，20]。本研究結(jié)果也提示，白藜蘆醇對缺血再灌注離體心臟具有明顯的恢復(fù)心臟功能，加強收縮力等作用，能夠減輕心肌細胞損傷，進而降低LDH以及CK指標，減小梗死面積，降低心肌梗死體積。這也進一步印證了白藜蘆醇具有明顯的心臟保護作用。本研究結(jié)果表明，白藜蘆醇通過抑制了離體缺血再灌注大鼠心肌中活性氧的產(chǎn)生和JNK的活化，抑制心肌細胞的凋亡，從而發(fā)揮心肌保護作用。

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