纖溶酶原激活劑抑制物-1基因啟動子區(qū)4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性及其單倍型與缺血性腦卒中的關聯(lián)分析

梁亮 何紅華 蔡靜怡 林斌

纖溶功能下降是多種血栓性疾病的重要發(fā)病機制之一,纖溶酶原激活劑抑制物-1主要生理功能為抑制組織型纖溶酶激活物和尿激酶型纖溶酶激活物的活性,是參與調節(jié)纖溶系統(tǒng)活性的平衡的重要組成部分,而纖溶活性的平衡是防止血栓形成的重要保護機制。目前研究發(fā)現(xiàn),血漿PAI-1水平受多種環(huán)境因素及遺傳因素影響,其中PAI-1基因啟動子區(qū)的某些功能性單核苷酸多態(tài)性如4G/5G、-844G/A與血漿PAI-1水平的增高有關。但PAI-1基因單核甘酸多態(tài)性與缺血性心腦血管疾病在不同地區(qū),人群及種族的研究結果不一致,一直存在爭議。本研究初步探討了位于PAI-1基因啟動子區(qū)域的4G/5G、-844G/A單核苷酸多態(tài)性與缺血性腦卒中(IS)發(fā)病的關系,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有對象來自廣東粵西地區(qū)漢族人。其中病例組系2002年8月～2003年8月本院神經(jīng)內科住院的72 h發(fā)病的初治缺血性腦卒中患者共130例,為病例組,男78例,女52例,平均年齡(64.81±8.87)歲。所有病例均符合WHO診斷標準。正常對照組：隨機選擇同期健康體檢者,均排除心、腦血管疾病,無高血壓、糖尿病、高血脂及遺傳疾病史,共112例,對照組男67例,女45例,平均年齡(63.05±7.06)歲。

1.2 方法 缺血性腦卒中患者(發(fā)病后,治療前)及正常對照組個體于清晨空腹、臥位采集肘靜脈血5 ml,以3.8%枸櫞酸鈉1：9抗凝,室溫下離心分離血漿置于- 80℃保存,酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)檢測血漿PAI-1水平。

1.3 采用鹽抽提法[1],稍作改良以從白細胞中抽提基因組DNA。

1.4 PCR擴增 參照文獻[2]設計引物序列,序列及酶解片段見表1 (引物由上海工生物工程技術服務有限公司合成)。擴增體系如下：總反應體積25 μl,含待測基因組DNA 0.2 μg,dNTP 0.2 mmol/L,MgCl21.5～2.5 mmol/L,10×buffer 2.5 μl,Taq酶0.75 U,上下游引物各42 μmol/L,擴增條件為：95℃預變性7 min,94℃變性55 s,退火條件見表1,72℃50 s,循環(huán)32次。

1.5 酶切PCR產(chǎn)物及電泳分析 取-844G/A位點的PCR產(chǎn)物15 μl,加入限制內切酶Xho I 5 U及相應酶切緩沖液37℃水浴過夜。將4G/5G位點 PCR擴增產(chǎn)物及-844G/A位點酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳,用溴化乙錠染色,紫外線燈照射下觀察并照相。根據(jù)電泳圖譜確定基因型。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有資料輸入Microsoft Excel 97中建立數(shù)據(jù)庫,并運用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析處理。應用基因記數(shù)方法計算出相對等位基因頻率。計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,用t檢驗,基因型Hardy-Weinberg平衡吻合度采用χ2檢驗。采用EH+軟件進行連鎖不平衡分析及單倍型分析。多態(tài)性位點與缺血性腦卒中患病風險之間的相關性用比值比(odds ratios,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence intervals,CI)表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病例組及對照組臨床資料比較 見表2。兩組樣本中的性別比例、年齡、總膽固醇、甘油三脂、血糖水平等均無統(tǒng)計學意義,而血壓(收縮壓和舒張壓)和血漿PAI-1水平的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布 病例組及對照組中4G/5G、-844G/A多態(tài)性位點基因型分布均符合Hard-Weinberg平衡,均具有群體代表性。病例組和對照組之間兩個位點的基因型頻率和等位基因頻率的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3。

2.3 單倍型分析 PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性所構建的單倍型有4種,見表4。單倍型分析結果顯示4G-A-844在病例組的頻率較高,與對照組的差異有統(tǒng)計學意義,而5G-G-844在對照組的分布頻率高于病例組(P＜0.01)。

表1 PAI-1基因性4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)的引物序列、退火條件、擴增片段、基因型及酶切片段長度

表2 缺血性腦卒中與對照組臨床資料比較(±s)

表2 缺血性腦卒中與對照組臨床資料比較(±s)

項目 對照組(n=112) 病例組 (n=130) P性別(男/女) 67/45 78/52 NS年齡(歲) 63.05±7.06 64.81±8.87 NS甘油三脂(mmol/L) 1.605±0.601 2.204±1.072 NS膽固醇(mmol/L) 5.191±0.887 4.959±1.034 NS收縮壓(mm Hg) 118.3±18.4 148.8±26.4 0.01舒張壓(mm Hg) 73.6±9.7 86.5±11.7 0.01空腹血糖(mmol/L) 5.306±0.699 5.993±1.786 NS血漿PAI-1水平(ng/ml) 23±14 36±15 0.01

表3 病例組和對照組PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較(±s)

表3 病例組和對照組PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較(±s)

0.6577 0.3423 1.789 1.341～2.386對照組 112 26(23.2) 0.5117 0.4883 P＜0.01-844G/A GG GA+AA G A病例組 130 31(23.8) 75(57.7)+24(18.5)52(46.4)+13(11.6)組別 例數(shù) 基因型(%) 等位基因 比值比(OR) 95%可信區(qū)間(CI)4G/5G 4G4G 4G5G+5G5G 4G 5G病例組 130 61(46.9) 49(37.7)+20(15.4)64(57.1)+22(19.4)0.5270 0.4730 1.681 1.299～2.173對照組 112 47(42.0) 0.6518 0.3482 P＜0.05

表4 病例組和對照組的PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性所構建的單倍型比較

3 討論

體外實驗發(fā)現(xiàn),PAI- 1基因4G/5G多態(tài)性位點的5G等位基因與 4G等位基因相比,在 PAI- 1啟動子區(qū)插入了 1 個堿基而創(chuàng)造了一個核蛋白(因子B)的結合位點,此蛋白可行使轉錄抑制作用。而4G位點只結合轉錄因子,具有較高的PAI-1基因轉錄速率,且4G/4G純合子型者的細胞有較高的 PAI- 1 分泌功能和血漿較高 PAI- 1水平。PAI-1基因啟動子區(qū)的另一個單核甘酸多態(tài)性位點-844G/A位于潛在的Ets蛋白DNA的限制序列,能影響PAI-1基因的轉錄[3]。提示血漿 PAI-1 水平和 PAI-1 基因啟動子區(qū)4G/ 5G、-844G/A等功能性位點之間有直接關系。高水平的PAI-1可以抑制t-PA ,導致纖溶活性降低,參與血栓的形成; 同時促進動脈粥樣硬化及動脈壁增厚,故易于導致缺血性腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生。近年來的病例對照研究結果表明PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性位點與IS的發(fā)病密切相關,是IS的重要危險因子之一,可增加IS的發(fā)病風險[4,5]。然而,亦有部分研究結果未發(fā)現(xiàn)PAI-1基因多態(tài)性與IS關聯(lián)。

本文研究結果顯示,在IS組中,以4G/5G位點的4G4G基因型個體為多,其分布頻率最高(0.469),4G等位基因的頻率為0.6577。而正常對照組4G/5G位點4G4G基因型相對較低(0.232),4G、5G等位基因的頻率分別為0.5117、0.4883,與病例組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。對照組-844G/A位點的野生型GG、雜合子GA、純合子AA的頻率分別為0.420、0.464、0.116。與對照組比較,IS組GG基因型分布頻率明顯降低(0.238),A-844等位基因頻率的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 上述研究結果說明4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性與IS 關聯(lián),4G/5G 的4G、A-844等位基因的攜帶者比非攜帶者患IS的相對危險度(OR)分別大1.789倍、1.681倍。本文的研究結果與國內Shaoyong Su等人報道相似,通過一組病例對照研究發(fā)現(xiàn),在非吸煙人群中,4G/5G位點的4G等位基因、-844G/A位點的A等位基因與冠心病的發(fā)病風險相關。

4G/5G和-844G/A單核甘酸多態(tài)性毗鄰,均位于PAI-I基因啟動子區(qū)域。通常認為相距較近的位點連鎖不平衡程度較緊密。Kathiresan等的研究認為由于4G/5G和-844G/A單核甘酸多態(tài)性之間存在緊密連鎖不平衡關系,故不易判斷哪個位點通過影響血漿PAI-1水平而導致缺血性心腦血管疾病的發(fā)生。因此,為了進一步了解兩個位點與IS 的關系,作者構建了兩個位點的單倍型,發(fā)現(xiàn)病例組和對照組之間4G-A-844和5G-G-844單倍型分布差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。對照組中5G-G-844的頻率明顯高于病例組(P＜0.01),表明該單倍型與降低IS 的風險關聯(lián),可能是保護性單倍型,而病例組中4G-A-844的頻率高于對照組(P＜0.01),提示該單倍型與IS的易感性關聯(lián),攜帶單倍型4G-A-844可能會增加患IS的風險。

總之,本研究中分析了廣東粵西地區(qū)PAI-1基因啟動子區(qū)4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性在IS患者中的分布頻率差異,并研究與疾病發(fā)生危險的相關性。結果表明4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性與IS 密切關聯(lián),4G/5G 的4G、A-844等位基因可以增加患IS 的危險性,單倍型4G-A-844可能為IS的遺傳易感因素。上述研究結果將為缺血性腦卒中的一、二級預防提供一定的線索及理論依據(jù)。

[1]Lahiri DK,Schuabel B.DNA isolation by a rapid method from human blood samples:effects of MgCl2,EDTA,storage time,and temperature on DNA yield and quality.Biochem Genet,1993(32):321-328.

[2]Henry M,Chomiki N,Scarabin PY,et al.Five frequent polymorphisms of the PAI-1 gene.Lack of association between genotypes,PAI activity,antriglyceride levels in healthy population.Arterioscler Thromb Vasc Biol ,1997,17(5):851-858.

[3]Dawson SJ ,Wiman B ,Hamsten A ,et al.The two allele sequences of a common polymorphism in the promoter of the plasminogen activator inhibitor-1 gene respond differently to interlerkin-1 in HepG2 cells.J Biol Chem,1993(268):1039-1045.

[4]Roest M ,vander Schouw YT,Banga JD,et al.Plasminogen activator inhibitor 4G polymorphism is associated with decreased risk of cerebrovascular mortality in older women.Circulation,2000(101):67-70.

[5]Sarra Saidi,Lamia B,Slamia,et al.Association of PAI-1 4G/5G and-844G/A Gene Polymorphism and Changes in PAI-1/tPA Levels in Stroke.A Case-Control Study,2007,16(4) : 153-159.