犬椎間盤(pán)脫出模型的建立及其脊髓微循環(huán)與組織學(xué)變化觀察

王雪喬，饒宇騰，吳偉澎，程 鵬，李 偉，姜代勛，陳 武

(1.北京農(nóng)學(xué)院(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

椎間盤(pán)脫出癥是人類(lèi)醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床上犬的多發(fā)病和疑難病。通過(guò)外科手術(shù)減壓療法解除脊髓壓迫，是常用治療方法之一，但在犬對(duì)深部痛覺(jué)喪失超過(guò)48 h的重癥病例無(wú)效。然而以電針為主的針灸療法，在無(wú)創(chuàng)的情況下對(duì)犬的椎間盤(pán)脫出癥顯示療效同樣顯著[1]，其機(jī)理可能與改善脊髓微循環(huán)和組織微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。由于對(duì)臨床病例的脊髓狀態(tài)評(píng)價(jià)困難，且已有的犬椎間盤(pán)脫出模型多為短時(shí)間(0.5～1) h壓迫[2-4]，不能很好地模擬和評(píng)價(jià)重癥椎間盤(pán)脫出癥的過(guò)程。本研究嘗試建立犬的椎間盤(pán)長(zhǎng)時(shí)間脫出模型，并采用激光散斑多普勒血流測(cè)定法(Laser-Doppler flowmetry, LDF)監(jiān)測(cè)壓迫后脊髓血流量(spinal cord blood flow, SCBF )和組織學(xué)變化，為進(jìn)一步揭示犬椎間盤(pán)脫出癥的病理與治療機(jī)理積累資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雜種犬9只，體重(5～10) kg (7.97±1.03)，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)[SCXK(京)2011-0006]，飼養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房[SYXK(京)2010-0003]。實(shí)驗(yàn)犬隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=3)，模型組(n=6)。正常對(duì)照組不進(jìn)行手術(shù)，常規(guī)飼喂。

1.2 主要儀器和試劑耗材

激光多普勒散斑血流檢測(cè)視頻系統(tǒng)(PeriCam PSI System, Perimed, Sweden)，呼吸麻醉機(jī)(SurgiVet,美國(guó))，超聲骨刀(速邁醫(yī)療)，高頻電刀(北京中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司)，碘海醇(50 mL：15 g，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司)，異氟烷(100 mL，魯南貝特制藥有限公司)，注射用氨芐西林(悅康藥業(yè)集團(tuán)北京凱悅制藥有限公司)，6Fr一次性無(wú)菌雙腔導(dǎo)尿管(大連庫(kù)利艾特醫(yī)療制品有限公司)，焦油紫(Sigma-Aldrich)，蘇木精(Amresco Company)，伊紅(Amresco Company)。

1.3 犬椎間盤(pán)脫出模型的建立

麻醉前15 min阿托品(0.02 mg/kg)皮下給藥，靜脈推注丙泊酚(6 mg/Kg)誘導(dǎo)麻醉，氣管插管異氟烷吸入維持麻醉。

動(dòng)物俯臥保定，以第一腰椎(L1)為中心消毒。手術(shù)嚴(yán)格無(wú)菌操作，第13胸椎至第2腰椎(T13-L2)棘突左側(cè)旁開(kāi)約1.5 cm切開(kāi)皮膚，沿皮膚切口切開(kāi)皮下脂肪，顯露并切開(kāi)淺深層外筋膜，鈍性分離髂腰肋肌纖維，骨膜剝離器鈍性剝離背最長(zhǎng)肌、多裂肌，切斷附著肌腱，牽引器緊貼肋頭前緣放置在創(chuàng)口前后，高頻電刀切斷乳頭突周?chē)街∪?，用咬骨鉗去除乳頭突，超聲骨刀打磨L1-L2段錐板，錐板咬骨鉗暴露左腹側(cè)L1-L2段脊髓。將6Fr雙腔導(dǎo)尿管沿硬膜向前伸至T12-T13，向內(nèi)緩慢注入約0.5 mL碘海醇(圖1)，封堵固定導(dǎo)尿管，脊髓血流監(jiān)測(cè)完畢后分層縫合切口。術(shù)后肌注抗生素(氨芐西林，25 mg/kg，每天3次)，第2天正常飼喂，對(duì)食欲不振者行常規(guī)輸液支持療法。

術(shù)后進(jìn)行X線檢查，確認(rèn)氣囊壓迫存在(圖2)，并進(jìn)行運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分，判斷造模是否成功。

壓迫48 h后氣囊減壓，抽出導(dǎo)管解除壓迫。

圖1 球囊壓迫法，沿硬膜插入后注入碘海醇。

圖2 犬椎間盤(pán)脫出模型壓迫后X線片。

1.4 SCBF微循環(huán)測(cè)定

術(shù)中暴露L1-L2段脊髓后，LDF散斑血流檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)血流5 min，導(dǎo)尿管壓迫后監(jiān)測(cè)血流5 min，14 d后再次開(kāi)創(chuàng)暴露脊髓，監(jiān)測(cè)相同脊髓段血流10 min。(儀器相關(guān)參數(shù)設(shè)定: 監(jiān)測(cè)激光與L1-L2段脊髓垂直，探頭與L1-L2段脊髓左側(cè)的監(jiān)測(cè)距離設(shè)定約為16 cm，分辨率為0.15mm，監(jiān)測(cè)區(qū)域圖像面積約10～15 mm2，圓心位于L1段脊髓左側(cè)的中心，采樣頻率: 10圖像/s)

1.5 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

同一執(zhí)業(yè)臨床獸醫(yī)師于術(shù)前、1 d、4 d、7 d、14 d采用犬TSCIS評(píng)分法[6-7]，從步態(tài)、本體感受器定位、痛覺(jué)感受方面對(duì)各組犬的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)(正常為10分)。 步態(tài)：最小離地間隙是指在犬肢體伸展時(shí)將四肢抬離地面的能力；本體感受器定位：本體感受的測(cè)定方法：給予外力支撐犬的體重，輕輕地將其爪背面著地，恢復(fù)正常位置的時(shí)間超過(guò)2 s則判為反應(yīng)遲鈍。傷害感受：深部傷害感受的測(cè)定方法：止血鉗橫行鉗閉遠(yuǎn)端肢體或者甲床。淺部傷害感受的測(cè)定方法：止血鉗鉗夾趾間蹼。

1.6 脊髓組織病理學(xué)觀察

14 d后采集損傷段脊髓，HE和焦油紫染色觀察脊髓組織學(xué)變化并進(jìn)行神經(jīng)元計(jì)數(shù)。觀察脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)及神經(jīng)元數(shù)量變化，脊髓中央管水平線以下設(shè)為計(jì)數(shù)面積，神經(jīng)元采用人工雙盲計(jì)數(shù)法[8]，P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 犬椎間盤(pán)脫出模型的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)果

圖3 犬壓迫前后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)果(P<0.01)

圖3可見(jiàn)，術(shù)前TSCIS評(píng)分結(jié)果皆為滿分10分。術(shù)后第1天左、右后肢的評(píng)分結(jié)果分別為(0.33±0.23)、(0.67±0.37)，兩后肢均喪失深部痛覺(jué)。與壓迫前相比，后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分下降極顯著(P<0.01)，至術(shù)后14 d左后肢(3±0.37)、右后肢(4±0.71)運(yùn)動(dòng)機(jī)能評(píng)分有所升高，但與術(shù)前相比仍舊極顯著下降(P<0.01)，模型建立成功。正常對(duì)照組1 d及14 d左右后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分均為滿分10分。

2.2 犬椎間盤(pán)脫出模型脊髓血流量變化

圖4 犬椎間盤(pán)脫出模型壓迫前后脊髓血流量變化(P<0.05)

犬椎間盤(pán)脫出模型壓迫后5 min(94.08±12.52)和14 d后(97.36±10.39)脊髓血流量顯著低于(P<0.05)壓迫前(131.02±5.67)(圖4)。

2.3 犬椎間盤(pán)脫出模型脊髓組織形態(tài)學(xué)觀察

正常對(duì)照組脊髓白質(zhì)纖維束排列緊密有序，左側(cè)腹角灰質(zhì)可見(jiàn)深藍(lán)色大而圓的神經(jīng)元且數(shù)量較多，多突起，胞漿內(nèi)尼氏小體結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核位于中央；模型組脊髓白質(zhì)纖維束斷裂，成空泡狀，灰質(zhì)可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞崩裂，尼氏小體不明顯，神經(jīng)元數(shù)量減少，出現(xiàn)固縮。脊髓腹角(脊髓中央管水平線以下)正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)模型組為(13.58±3.14)個(gè)，極顯著低于(P<0.01)正常對(duì)照組(34.52±4.68)個(gè)(圖5,6見(jiàn)彩插1)。

3 討論

椎間盤(pán)脫出癥是由于椎間盤(pán)的纖維環(huán)變性破裂，中央髓核脫出壓迫脊髓及其相應(yīng)脊神經(jīng)根，導(dǎo)致神經(jīng)通路被阻斷，同時(shí)壓迫造成脊髓血液循環(huán)障礙，加速神經(jīng)細(xì)胞死亡，引起運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙[9]。臨床實(shí)踐中，動(dòng)物短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的重度癱瘓往往伴隨后肢深部痛覺(jué)完全喪失甚至尿閉或尿失禁，這多由于髓核瞬時(shí)壓迫引起脊髓急性損傷，隨著壓迫持續(xù)存在進(jìn)而引起脊髓局部缺血缺氧造成繼發(fā)性損傷[9]。球囊壓迫法能夠較好地模擬椎間盤(pán)脫出引起的急性重度持續(xù)性壓迫，并可對(duì)壓迫程度進(jìn)行適度的調(diào)節(jié)，且重復(fù)性良好。早期球囊壓迫法是通過(guò)椎板全切術(shù)暴露脊髓進(jìn)行壓迫，但對(duì)脊髓周?chē)M織的損傷較大。經(jīng)過(guò)改良，現(xiàn)多采用經(jīng)皮穿刺至蛛網(wǎng)膜下腔后壓迫[10-13]，但此法也有其局限性，主要是壓迫位置很難準(zhǔn)確定位在脊髓正下方或側(cè)下方，因而無(wú)法模擬椎間盤(pán)髓核脫出對(duì)脊髓的壓迫。此外，由于沒(méi)有暴露脊髓，所以無(wú)法直接監(jiān)測(cè)脊髓微循環(huán)血流量的變化。本研究采用的半椎板切除術(shù)是解除髓核壓迫的臨床常用手術(shù)通路，其既減少對(duì)脊髓周?chē)M織的損傷又客觀評(píng)價(jià)脊髓狀態(tài)，更接近犬椎間盤(pán)脫出癥的自然損傷過(guò)程，符合理想椎間盤(pán)脫出模型的要求。球囊內(nèi)注入碘海醇代替生理鹽水，有利于術(shù)中定位及術(shù)后評(píng)價(jià)。研究結(jié)果模型組后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能極顯著下降，出現(xiàn)后肢癱瘓，失去深部痛覺(jué)，與臨床上犬的椎間盤(pán)脫出癥一致。

微循環(huán)障礙是機(jī)體原發(fā)性和繼發(fā)性致病的重要因素，也與細(xì)胞再生和機(jī)能恢復(fù)密切相關(guān)，因此對(duì)其進(jìn)行測(cè)定能客觀評(píng)價(jià)脊髓損傷和機(jī)能恢復(fù)的程度。激光散斑血流監(jiān)測(cè)儀是一種監(jiān)測(cè)組織血流的常用方法，其通過(guò)光電探測(cè)器接受反射光，然后轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，生成組織血細(xì)胞移動(dòng)的數(shù)據(jù)。Yasminda Malik等[14]指出LDF受多種因素影響，例如室溫、體位、外部光源等因素。為此，本實(shí)驗(yàn)在監(jiān)測(cè)過(guò)程中保持室溫在25℃，關(guān)閉無(wú)影燈，加熱毯溫度保持在38℃，輸液暫停，同時(shí)人員保持安靜，減少走動(dòng)，盡最大可能減少干擾因素，以獲取可信的數(shù)據(jù)。

課題組前期研究表明椎間盤(pán)脫出大鼠模型SCBF下降顯著，且壓迫后即刻下降，前后分界明顯[5]。本試驗(yàn)觀察到椎間盤(pán)脫出模型犬SCBF同樣下降顯著，但壓迫后瞬時(shí)脊髓血流量呈緩慢下降至穩(wěn)定值，這可能與壓迫物選擇不同和種屬間差異有關(guān)。壓迫后脊髓血流量顯著下降，且14 d后脊髓血流量仍保持較低水平，這說(shuō)明急性和慢性的脊髓血流微循環(huán)障礙可能是椎間盤(pán)脫出癥致病的重要機(jī)制。

造模后14 d在觀察到脊髓微循環(huán)血流量顯著降低的同時(shí)，模型組出現(xiàn)神經(jīng)元變性壞死、尼氏小體固縮、白質(zhì)空泡化等形態(tài)學(xué)變化。已有研究表明脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元的遷移受血管密度和分布影響[15]，說(shuō)明脊髓微循環(huán)障礙對(duì)神經(jīng)元修復(fù)的影響。提示調(diào)節(jié)脊髓微循環(huán)，改善脊髓神經(jīng)細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞再生和重構(gòu)可能是治療該病的關(guān)鍵。14 d后脊髓造影顯示壓迫部位造影劑仍無(wú)法正常通過(guò)，說(shuō)明壓迫并未隨著解壓而消失，這可能正是發(fā)病48 h后手術(shù)減壓效果不佳的原因。

上述結(jié)果表明，此球囊壓迫法建立的重度椎間盤(pán)脫出模型能夠再現(xiàn)臨床經(jīng)過(guò)，可以作用于觀察脊髓微循環(huán)和組織形態(tài)學(xué)變化，用于該病病理和治療機(jī)理的相關(guān)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳武，吳英偉，郭澤領(lǐng)，等.犬椎間盤(pán)病的中西結(jié)合診療與病例分析[C]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)論文集，中國(guó)，中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)，2003，128-131.

[2] Lee JH,Choi CB,Chung DJ,et al. Development of an improved canine model of percutaneous spinal cord compression injury by balloon catheter[J]. J Neurosci Methods , 2008,167 :310-316.

[3] Lim JH,Jung CS,Byeon YE,et al. Establishment of a canine spinal cord injury model induced by epidural balloon compression[J]. J Vet Sci,2007,8:89-94.

[4] 于向華, 劉鄭生. 壓力球囊置入法致頸脊髓慢性壓迫實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕D]. 中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，碩士學(xué)位論文，2003.

[5] 盧知松，陳益山，姜代勛，等. 椎間盤(pán)脫出大鼠模型的脊髓血流量變化及電針效應(yīng)[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2011，19(5)：381-386.

[6] Gwendolyn JL,Jonathan M. L,Christine M. B,et al.Description and repeatability of a newly developed spinal cord injury scale for dogs[J].Prev Vet Med,2009,89:121-127.

[7] Byung OK,Ying L,Yiwen R,et al.Neuropathologies in transgenic mice expressing human immunodeficiency virus type 1 tat protein under the regulation of the astrocyte-specific glial fibrillary acidic protein promoter and doxycycline[J]. Am J Pathol, 2003,162:1693-1707.

[8] 虞攀峰，王巖. 新型犬脊髓損傷模型的建立和激光多普勒眷髓血流評(píng)價(jià)[D].中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院，軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，博士學(xué)位論文，2011.

[9] Lahunta AD,Glass EN. Veterinary Neuroanatomy and Clinical Neurology(Third Edition) [M]. American Elsevier, 2009. 243-280.

[10] Fukuda S,Nakamura T,Kishigami Y,et al.New canine spinal cord injury model free from laminectomy [J]. Brain Res Protoc, 2005,14:171-180.

[11] 盧鵬. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓的損傷模型[J]. 中國(guó)骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2008，23(2)：174-176.

[12] 白殿卿，沈?qū)幗? 犬脊髓損傷治療動(dòng)物模型[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2002，10(2)：120-122.

[13] Purdy PD, Duong RT, White CL, et al. Percutaneous translumbar spinal cord compression injury in a dog model that uses angioplasty balloons: MR imaging and histopathologic findings[J]. Am J Neuroradiol,2003,24:177-184.

[14] Yasminda M,David S,Martin K,et al.Laser-Doppler M easurements of spinal cord blood flow changes during hemilaminectomy in chondrodystrophic dogs with disk extrusion[J]. Vet Surg,2009,38:457-462.

[15] 王志新，王卉，王延芬，等.小鼠脊髓灰質(zhì)發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞遷移與血管之間的關(guān)系[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2013，29(4)：415-420.