嗜堿性粒細(xì)胞在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型小鼠Th1/Th2應(yīng)答失衡中的作用

陳秋華，唐 培，謝 彤，吳 平，蘭巧芬，XIAO Hai-yan ，潘慶軍

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣東，湛江 524001；2. Georgia Regents University, Cancer Center, Augusta, GA 30912, USA)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以慢性關(guān)節(jié)炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)和預(yù)后呈高度異質(zhì)性，易反復(fù)發(fā)作，致殘率較高，目前尚無(wú)較好的根治方法。RA發(fā)病機(jī)制雖尚未完全解析，但輔助性T細(xì)胞(Thl/Th2)應(yīng)答失衡在RA發(fā)病中的重要作用已被廣泛認(rèn)知[1]。然而，導(dǎo)致RA患者Th1/Th2失衡的原因及機(jī)制尚不清楚，因此，深入研究RA發(fā)病中Th1/Th2失衡的原因及機(jī)制將有助于RA的防治。

嗜堿性粒細(xì)胞參與過(guò)敏反應(yīng)已被熟知[2]，近年有關(guān)嗜堿性粒細(xì)胞在天然免疫、獲得性免疫、免疫平衡調(diào)節(jié)等方面的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展和令人矚目的成就。在免疫調(diào)節(jié)方面，嗜堿性粒細(xì)胞表面表達(dá)高水平的IgE受體FcεRI，通過(guò)與抗原特異IgE交聯(lián)，或其他的活化途徑，能產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子如IL-4和IL-13，介導(dǎo)Th0向Th2細(xì)胞分化[3，4]，而Th2型增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。因此，嗜堿性粒細(xì)胞可通過(guò)增強(qiáng)Th2應(yīng)答和削弱Th1應(yīng)答而影響Th1/Th2平衡，進(jìn)而參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程，但至今，在RA方面研究極少。

膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis, CIA)是最常用的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。由于其重復(fù)性好、易于界定、并被證實(shí)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎新療法的發(fā)展有用而被廣泛接受。

基于此，本文采用經(jīng)典的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型，探討嗜堿性粒細(xì)胞在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型Th1/Th2失衡中的作用。有望為RA的發(fā)病機(jī)制和臨床防治提供線索。

1 材料和方法

1. 1 動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)5～6周C57/BL6雄性小鼠，體重(15～18)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(粵監(jiān)證字2008A055，合格證號(hào)0045725)， 飼養(yǎng)在廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(粵) 2010-0063]，25℃ 12 h 晝夜節(jié)律、55%濕度的飼養(yǎng)箱環(huán)境，喂養(yǎng)商品飼料和滅菌自來(lái)水。

牛II型膠原(Type II collagen)和弗氏完全和不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。小鼠IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。紅細(xì)胞裂解液、染色液、固定通透液、抗小鼠CD49B-FITC、IgE-PE抗體和APC-IL-4抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1. 2 方法

1. 2. 1 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的建立：依照參考文獻(xiàn)[5]，將牛II型膠原(Type II collagen)溶解于0.05 mol/L冰醋酸中，濃度為2 g/L，將溶解的膠原與弗氏完全佐劑等體積混合，在冰浴中使用勻漿器充分乳化。模型組小鼠6只，對(duì)照組6只。免疫時(shí)，在小鼠背部和尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1 mL乳劑(含100 mg 膠原和200 mg結(jié)核分支桿菌)。首次免疫后3周行第二次免疫，方法同第一次(佐劑換為弗氏不完全佐劑)，避開(kāi)初次免疫部位，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。同時(shí)，對(duì)照組用CFA與0.05 mol/L冰醋酸等體積充分乳化后按上述方法進(jìn)行免疫及21天加強(qiáng)免疫，制備膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型。

1.2.2 小鼠外周血和淋巴結(jié)組織采集和檢測(cè)：分別在建模(初次免疫)前、建模后1周、3、6和9周眶靜脈采血，肝素抗凝，并進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。同時(shí)進(jìn)行關(guān)節(jié)腫脹的評(píng)分。

淋巴結(jié)細(xì)胞的制備參考[6]將C57/BL6小鼠斷髓處死，無(wú)菌分離雙側(cè)頜下、腋窩、鎖骨下、腹股溝淺表和腸系膜淋巴結(jié)，去掉被膜，于200目尼龍網(wǎng)篩研磨過(guò)濾，于4℃下200 r/min離心8 min收集細(xì)胞，4℃下PBS(0.05 mol/L, pH 7.2)洗滌2次，重懸后流式檢測(cè)。

1. 2. 3 ELISA檢測(cè)血清IFN-γ和IL-4：分別在建模(初次免疫)前、建模后1周、建模后8周眶靜脈采血，300 r/min離心15 min，收集上清液，-20℃凍存，檢測(cè)備用。用ELISA方法檢測(cè)血清IL-4和IFN-γ水平。

1. 2. 4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周嗜堿性粒細(xì)胞：分別在建模(初次免疫)前、建模后1周、建模后8周眶靜脈采血，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)外周血和淋巴結(jié)組織中嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量和表達(dá)IL-4的比例檢測(cè)。具體為：取200 μL抗凝血，分別加入抗小鼠CD49B-FITC和IgE-PE抗體，室溫孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液，室溫避光15 min，300 r/min離心5 min，再用染色液重懸洗滌一次，再加入固定和透膜液10 min，離心去除固定和透膜液，染色液重懸后加入抗小鼠APC-IL-4抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色15 min，加入染色液離心洗滌2次，最后將標(biāo)記的細(xì)胞重懸200 μL染色液上流式檢測(cè)，CD49b和IgE雙陽(yáng)性為嗜堿性粒細(xì)胞，再計(jì)算IL-4陽(yáng)性的嗜堿性粒細(xì)胞占總嗜堿性粒細(xì)胞的比例。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)都采用SPSS 13.0分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)。對(duì)照組和模型組檢測(cè)指標(biāo)比較使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent Student’st-test)，P<0. 05認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2. 1 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的建立

初次免疫后3周(既第21天)左右小鼠關(guān)節(jié)開(kāi)始出現(xiàn)腫脹，起初為兩后足紅腫，逐漸延伸到前足和尾部，第42天左右腫脹達(dá)到最高，而后逐漸減輕。小鼠毛色、精神狀態(tài)和糞便等在21 d前無(wú)顯著變化，21 d后CIA組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)被毛松弛，行動(dòng)遲緩，關(guān)節(jié)腫脹明顯，少數(shù)小鼠可見(jiàn)局部足爪輕度潰瘍(圖1)。小鼠關(guān)節(jié)腫脹的評(píng)分見(jiàn)表1。

圖1 對(duì)照組和CIA模型組小鼠后足初次免疫后第42天腫脹情況

2. 2 血清IFN-γ和IL-4的比值

CIA模型小鼠誘導(dǎo)早期，既初次免疫后1周和3周，血清IFN-γ/IL-4水平的比值顯著低于對(duì)照組(圖2)，提示Th2應(yīng)答失衡。而CIA模型小鼠誘導(dǎo)中晚期，既初次免疫后6周和9周，血清IFN-γ/IL-4的比值顯著高于對(duì)照組(圖2)，提示以Th1應(yīng)答為主。

圖2 CIA模型組和對(duì)照組小鼠血清IFN-γ/IL-4水平的比值的變化情況(*，P <0.05；**，P <0.01)

2. 3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量和活化情況

CIA模型小鼠誘導(dǎo)早期，既初次免疫后1周和3周，外周嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組(圖3A)。而CIA模型小鼠誘導(dǎo)中晚期，既初次免疫后6周和9周，外周嗜堿性粒細(xì)胞IL-4陽(yáng)性的百分比顯著高于對(duì)照組(圖3B)。

2. 4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴結(jié)組織中嗜堿性粒細(xì)胞

CIA模型小鼠誘導(dǎo)早期，既初次免疫后1、3、6和9周，淋巴結(jié)組織中可檢測(cè)到嗜堿性粒細(xì)胞，對(duì)照組小鼠則無(wú)(圖4)。

表1 小鼠關(guān)節(jié)腫脹的評(píng)分

圖3 CIA模型組和對(duì)照組小鼠外周血嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量和活化變化情況(*，P <0.05；**，P <0.01)

圖4 流式檢測(cè)CIA模型組和對(duì)照組小鼠淋巴結(jié)組織中嗜堿性粒細(xì)胞

3 討論

RA患者Thl/Th2應(yīng)答失衡模式的研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生在RA疾病的早期和晚期不同，提示在不同發(fā)病期可能存在Thl/Th2應(yīng)答失衡模式的改變。在RA發(fā)病早期外周血單個(gè)核細(xì)胞中以Th2應(yīng)答為主，而長(zhǎng)期慢性RA則以Th1應(yīng)答為主[1]。而且，在RA出現(xiàn)臨床關(guān)節(jié)病變的最早期，在滑膜和滑膜液中呈現(xiàn)短暫的以Th2為主的細(xì)胞因子譜(IL-4和IL-13等)，而顯著缺乏Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ等)，這可決定早期滑膜炎發(fā)展成RA而不是非類風(fēng)濕持久性滑膜炎[7]。在1例成年RA患者活動(dòng)期滑膜中首先發(fā)現(xiàn)以Th2應(yīng)答為主，而外周單個(gè)核細(xì)胞中以Th1應(yīng)答為主，而后滑膜中發(fā)展為以Th0和Th1應(yīng)答為主，且與RA炎癥相關(guān)[8]。提示，在RA患者外周血和關(guān)節(jié)滑膜液中Th1/Th2應(yīng)答失衡的模式，在不同病期可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)換。

嗜堿性粒細(xì)胞通過(guò)IgE高親和力受體FcεRl與IgE-抗原復(fù)合物交聯(lián)，可誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞活化進(jìn)而釋放炎性介質(zhì)而介導(dǎo)組織損傷。RA患者高滴度的IgE抗體主要以免疫復(fù)合物形式存在[9]，在外周血和關(guān)節(jié)液中可檢測(cè)到包含IgE抗體的循環(huán)免疫復(fù)合物(IgE-CIC)[10-12]，且IgE-CIC陽(yáng)性的RA患者疾病活動(dòng)度高于陰性的RA患者[13]，IgE-CIC可活化炎癥效應(yīng)細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等[14,15]，促進(jìn)RA疾病進(jìn)展。瓜氨酸化蛋白和IgE型抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)形成的免疫復(fù)合物可通過(guò)FcεRI受體交聯(lián)活化RA患者嗜堿性粒細(xì)胞[16]。提示在RA中IgE型免疫復(fù)合物可能介導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞活化，其介導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞的活化在RA發(fā)病中的作用有待進(jìn)一步研究。

另外，本模型選用的是C57/BL6小鼠，在天然免疫中以Th1應(yīng)答為主，而B(niǎo)ALB/c則以Th2應(yīng)答為主[17]，基于本項(xiàng)目中Th1/Th2應(yīng)答與CIA模型誘導(dǎo)密切相關(guān)，而嗜堿性粒細(xì)胞是影響Th1/Th2應(yīng)答，特別是Th2應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞，故研究嗜堿性粒細(xì)胞在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型小鼠Th1/Th2應(yīng)答失衡中的作用時(shí)，要考慮C57/BL6小鼠和BALB/c不同背景的可能影響。

臨床上關(guān)于RA患者嗜堿性細(xì)胞的研究報(bào)道比較少，一個(gè)以800例RA患者為主的研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且處于活化狀態(tài)(以脫顆粒為活化標(biāo)志)[18]。而另外一個(gè)以16例兒童RA患者為主的報(bào)道發(fā)現(xiàn)，幼年RA患者(juvenile rheumatoid arthritis, JRA)外周血嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量以增多為主(11/16)[19]。但目前，幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(JRA)現(xiàn)已更名為幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis, JIA)研究例數(shù)較少。另外根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，我們推測(cè)，可能與JRA患兒確診時(shí)大部分處于發(fā)病的早期，而成年RA患者確診時(shí)大部分處于發(fā)病的中晚期相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上，嗜堿性粒細(xì)胞可能在CIA模型小鼠Th1/Th2應(yīng)答失衡中發(fā)揮了作用，進(jìn)而參與其發(fā)病過(guò)程。但CIA模型小鼠嗜堿性粒細(xì)胞活化和外周減少的機(jī)制，以及調(diào)控嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量和活化對(duì)CIA模型小鼠疾病進(jìn)展的影響有待進(jìn)一步深入研究，該研究有望為闡明RA發(fā)病機(jī)制和針對(duì)RA發(fā)病中Th1/Th2失衡的干預(yù)治療提供新的線索。

參考文獻(xiàn)：

[1] Schulze-Koops H, Kalden JR. The balance of Th1/Th2 cytokines in rheumatoid arthritis[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol, 2001， 15(5):677-691.

[2] 潘慶軍, 劉淵, 富寧. 嗜堿性粒細(xì)胞在過(guò)敏和免疫反應(yīng)中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2009， 23(1):25-28.

[3] Charles N, Watford WT, Ramos HL, et al. Lyn kinase controls basophil GATA-3 transcription factor expression and induction of Th2 cell differentiation [J]. Immunity, 2009, 30:533-543.

[4] Sokol CL, Barton GM, A.G. Farr AG, et al. A mechanism for the initiation of allergen-induced T helper type 2 responses [J]. Nat Immunol, 2008， 9:310-318.

[5] Campbell IK, Hamilton JA, Wicks IP. Collagen-induced arthritis in C57BL/6 (H-2b) mice: new insights into an important disease model of rheumatoid arthritis [J]. Eur J Immunol, 2000， 30:1568-1575.

[6] 梁兆端, 曾耀英, 黃秀艷, 等. 芹菜素對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2008，24(4):337-340.

[7] Raza K, Falciani F, Curnow SJ, et al. Early rheumatoid arthritis is characterized by a distinct and transient synovial fluid cytokine profile of T cell and stromal cell origin [J]. Arthritis Res Ther, 2005，7(4):R784-795.

[8] Aarvak T, Chabaud M, Thoen J, et al. Changes in the Th1 or Th2 cytokine dominance in the synovium of rheumatoid arthritis (RA): a kinetic study of the Th subsets in one unusual RA patient [J]. Rheumatology (Oxford), 2000，39(5):513-522.

[9] Millauer N, Zuercher AW, Miescher SM, et al. High IgE in rheumatoid arthritis (RA) patients is complexed with anti-IgE autoantibodies [J]. Clin Exp Immunol, 1999,115(1):183-188.

[10] De Clerck LS, Struyf NJ, Bridts CH, et al. Activation of inflammatory cells by immune complexes containing IgE in serum and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis: a study using flow cytometric analysis [J]. Ann Rheum Dis, 1991,50(6):379-382.

[11] Van Offel JF, De Clerck LS, Kersschot IE. Cholesterol crystals and IgE-containing immune complexes in rheumatoid pericarditis [J]. Clin Rheumatol, 1991，10(1):78-80.

[12] De Clerck LS, Struyf NJ, Bridts CH, et al. IgE-containing immune complexes in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis [J]. Clin Rheumatol, 1990，9(2):176-81.

[13] Bartholomew JS, Evanson JM, Woolley DE. Serum IgE anti-cartilage collagen antibodies in rheumatoid patients [J]. Rheumatol Int, 1991,11(1):37-40.

[14] Sokol CL, Barton GM, Farr AG, et al. A mechanism for the initiation of allergen-induced helper type 2 responses [J]. Nat Immunol, 2008，9(3):310-318.

[15] Athreya BH, Moser G, Raghavan TE. Increased circulating basophils in juvenile rheumatoid arthritis. A preliminary report [J]. Am J Dis Child, 1975,129(8):935-937.

[16] Schuerwegh AJ, Ioan-Facsinay A, Dorjée AL, et al. Evidence for a functional role of IgE anticitrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(6):2586-2591.

[17] Watanabe H, Numata K, Ito T, et al. Innate immune response in Th1- and Th2-dominant mouse strains [J]. Shock, 2004，22(5):460-466.

[18] 高恩, 相家倫. 嗜堿性粒細(xì)胞用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動(dòng)性的診斷 [J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)),1986, 03:40.

[19] Athreya BH, Moser G, Raghavan TE. Increased circulating basophils in juvenile rheumatoid arthritis. A preliminary report [J]. Am J Dis Child， 1975， 129(8):935-937.