腸道嗜性和神經(jīng)嗜性SIV毒株Gp120序列變異特點的比對分析

徐 珮，叢 喆，陳 霆，王 衛(wèi)，薛 婧，駱 楊，吳小閑，魏 強

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

猴免疫缺陷病毒(SIV)在恒河猴體內(nèi)由于個體的免疫差異不同會形成具有不同組織嗜性的SIV準(zhǔn)種，如腸道嗜性和神經(jīng)嗜性病毒等。SIV的包膜區(qū)包含了主要的與細胞嗜性和細胞毒性等相關(guān)的基因序列，其中Gp120蛋白在病毒與靶細胞之間的結(jié)合感染過程中起到關(guān)鍵的作用[1]，因此了解不同嗜性病毒準(zhǔn)種的包膜Gp120蛋白序列之間的差異特點，將對SIV感染形成AIDS相關(guān)腸病和腦病的分子機制研究起到重大推進作用。

本實驗在實驗室前期工作基礎(chǔ)上從四只接種SIVmac239單克隆毒株的晚期發(fā)病恒河猴外周血淋巴細胞中分離病毒，比對了一個單克隆毒株在不同猴體內(nèi)的進化變異情況。同時對比分析腸病嗜性和神經(jīng)嗜性病毒Gp120蛋白的氨基酸序列以及N-糖基化位點變化，以期通過發(fā)現(xiàn)有義的的序列變異位點，為AIDS相關(guān)腸病和腦病的基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 病毒

4只中國恒河猴RM-391、RM-372、RM-409、RM-411直腸感染SIVmac239-P12一年后發(fā)病，外周血CD4+T細胞絕對數(shù)長期減少至200個/μL以下，分離4只猴外周血淋巴細胞，并與正常猴淋巴細胞共培養(yǎng)，擴增制備病毒，分別命名為SIVmac239-RM391、SIVmac239-RM372、SIVmac239-RM409和 SIVmac239-RM411。其中SIVmac239-RM391感染猴后可以在短期內(nèi)引起實驗猴急性亞急性胃腸道癥狀，嚴(yán)重腹瀉甚至死亡，是一株典型的艾滋病腸病病毒(數(shù)據(jù)未顯示)。

分離自SIVmac251感染晚期恒河猴大腦基底節(jié)的SIVmac251-155p6N感染恒河猴后出現(xiàn)明顯的腦神經(jīng)病理現(xiàn)象和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變[2]，本研究從感染猴R21755腦脊液和基底節(jié)中分離到兩株病毒，分別命名為SIVmac251-THC-2-CSF和SIVmac251-THC-2-J。

1.2 有限稀釋法分離病毒單克隆毒株[3]

將待分離的病毒準(zhǔn)種用10%牛血清1640生長液10倍稀釋，稀釋8個滴度，將稀釋好的病毒加入96孔板中，每個滴度12個復(fù)孔，每孔100 μL。將生長狀態(tài)良好的CEMx174細胞(1×105個/孔)100 μL加入96孔板。37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4～6 d后可在顯微鏡下看到一些稀釋度的細胞出現(xiàn)形態(tài)變化：多個細胞融合，核膜消失，形成大的空泡。選取出現(xiàn)融合泡少于四個孔的稀釋度(陽性率小于30%認為是單克隆)，將這些陽性孔中細胞和上清轉(zhuǎn)出并添加正常細胞繼續(xù)擴大培養(yǎng)。病變程度達到++++時，收集細胞培養(yǎng)上清分裝凍存。

1.3 RT-PCR擴增及病毒env基因序列變異分析[2]

提取病毒RNA，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA，Cat No. 6110A)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用高保真酶Kod-plus (東洋紡公司，Cat No. kod-201)進行單拷貝PCR擴增env基因中長約1.6 kb 的片段，對基因序列做變異比對分析。序列經(jīng)Vector NTI Suite 8軟件編輯校正后，使用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件進行比對，MEGA4軟件作圖。美國Los Alamos國家實驗室HIV核酸序列庫網(wǎng)站提供標(biāo)準(zhǔn)序列及糖基化位點分析http://www.hiv.lanl.gov/。

2 結(jié)果

2.1 有限稀釋法分離病毒單克隆毒株結(jié)果

有限稀釋法分離的所有病毒單克隆毒株，提取病毒RNA后通過逆轉(zhuǎn)錄PCR比對分析env基因序列變異情況，共得到50株單克隆病毒的env序列(表1)。其中外周血來源的病毒準(zhǔn)種所含單克隆較多，腦組織來源的病毒準(zhǔn)種的單克隆比較少。

表1 有限稀釋法分離病毒單克隆毒株結(jié)果

圖1 SIVmac239-P12感染猴來源病毒 gp120基因的系統(tǒng)進化樹分析

2.2 SIVmac239-P12感染猴來源的病毒 gp120基因的系統(tǒng)進化樹分析

系統(tǒng)進化樹表示病毒毒株之間的進化關(guān)系。通過系統(tǒng)進化樹對4只感染猴來源的單克隆的gp120基因進行分簇，結(jié)果表明SIVmac239毒株在不同猴體內(nèi)發(fā)生了不同程度的變異進化，來源于同一只猴的病毒單克隆之間差異不是很大，在進化分組上仍屬于同一組。在4組準(zhǔn)種之間，SIVmac239-RM-372，SIVmac239-RM-391 和SIVmac239-RM-409這三組的序列較相近，SIVmac239-RM-411出現(xiàn)了較不同的變異，基因距離與其他三組較大(圖1)。

2.3 腸道癥狀感染猴與神經(jīng)癥狀感染猴來源毒株Gp120氨基酸序列的比對

SIVmac239-RM-391 和SIVmac251-THC-2來源的單克隆序列比對結(jié)果顯示(圖2)，腸病毒株與腦病毒株其Gp120氨基酸序列在其保守區(qū)和可變區(qū)均有差異，位于可變區(qū)的差異位點較多。這兩種來源毒株序列的差別主要集中在V1和V4區(qū)，腦病毒株在V1區(qū)和V4區(qū)出現(xiàn)了氨基酸位點的連續(xù)改變TPPT-AKA-STKSI(V1)和DMRD-TE-R(V4)。在V3區(qū)，分離毒株與SIV mac239標(biāo)準(zhǔn)序列有六處個氨基酸位點有差異，但兩種嗜性的毒株之間差異較小，在312位點，腸道嗜性毒株中14個為賴氨酸(K)，1個是精氨酸(R)；神經(jīng)嗜性毒株中4個是精氨酸(R)，2個是賴氨酸(K)。337位點神經(jīng)嗜性毒株都是纈氨酸(V)，而腸道嗜性毒株只有一個是(V)，其余都是異亮氨酸(I)。

注：391系列為腸道嗜性毒株，CSF和J系列為神經(jīng)嗜性毒株

2.4 腸道嗜性和神經(jīng)嗜性SIV毒株Gp120區(qū)糖基化位點預(yù)測

使用美國Los Alamos國家實驗室HIV核酸序列庫網(wǎng)站在線工具對腸道嗜性和神經(jīng)嗜性病毒單克隆Gp120區(qū)進行N-糖基化位點(N-X-S/N-X-T)的預(yù)測。預(yù)測結(jié)果顯示SIVmac239-RM-391和SIVmac251-THC-2毒株出現(xiàn)了糖基化位點的缺失和增多現(xiàn)象。對比SIVmac239標(biāo)準(zhǔn)序列，兩組嗜性毒株在V3區(qū)317位點(K-N)均有一個糖基化位點的增加。SIVmac239-RM-391來源的毒株在V4區(qū)有一個的糖基化位點的增加(419A-T)。在417位點SIVmac239標(biāo)準(zhǔn)序列為丙氨酸A，腸道嗜性為蘇氨酸T，神經(jīng)嗜性為精氨酸R。神經(jīng)嗜性毒株其糖基化位點的變化則出現(xiàn)在保守的C1、C2、C3區(qū)，在C1和C3區(qū)出現(xiàn)了糖基化位點的缺失(79N-D，373N-H/P)，C2區(qū)有一個糖基化位點的增加(256K-N)(圖3)。

3 討論

研究表明，在HIV自身的高變異特性上，HIV在體內(nèi)受到宿主免疫壓力的作用會產(chǎn)生一種連續(xù)的定向的突變趨勢以獲得有效的突變株，從而在宿主體內(nèi)存活繁殖。而在這些有效的突變毒株中，有一些毒株對宿主的組織器官的會產(chǎn)生不同的致病能力，即產(chǎn)生了不同的細胞嗜性和毒性的突變株。在早期的HIV基因組分子研究中，已明確了病毒包膜區(qū)對病毒的感染和復(fù)制的重要性[1]。包膜糖蛋白Gp120對病毒的細胞嗜性和細胞毒性的影響更是受到了關(guān)注。本實驗通過比對SIVmac239感染的四只恒河猴血漿分離病毒的Gp120序列，顯示同一SIV毒株在不同猴體內(nèi)會產(chǎn)生具有多元化的Gp120序列的病毒準(zhǔn)種，從我們所比對分析的四組SIV單克隆的基因系統(tǒng)進化樹結(jié)果來看，同一個體來源的單克隆也會有一定的差異，但從整體來看，四個來源的單克隆又分屬于自己的小組，并沒有出現(xiàn)明顯的交叉變異現(xiàn)象，這一點證實了個體免疫壓力差異會使SIV的變異產(chǎn)生一定的趨向性。

這種病毒變異的趨向性會形成一些特定毒株，可對宿主不同的器官組織產(chǎn)生致病性，現(xiàn)在已證實了一些腸道嗜性和神經(jīng)嗜性等HIV病毒株的存在[4.5.6]。Toshiaki Kodama等人從同一猴子的腸道和腦內(nèi)分離SIV，證實了這兩種嗜性病毒變異株的獨立進化性[7]。那么具有腸道嗜性和神經(jīng)嗜性的SIV毒株都有哪些特性呢？SIV病毒在猴體內(nèi)復(fù)制繁殖時，在體內(nèi)復(fù)雜的免疫壓力下，只有能夠有效感染靶細胞，且能逃避中和抗原作用的病毒才能在體內(nèi)建立穩(wěn)定的復(fù)制。SIV包膜蛋白Gp120是病毒膜表面唯一暴露在外環(huán)境中的糖蛋白，它對細胞嗜性和細胞毒性的影響在艾滋病研究中受到廣泛關(guān)注。Gp120按其可變性可分為5個保守區(qū)(C1～C5)和5個可變區(qū)(V1～V5)，5個保守區(qū)構(gòu)成了Gp120的結(jié)構(gòu)核心，CD4、趨化因子受體的結(jié)合位點和與gp41相互作用的主要位點等[8]。在病毒的嗜性形成中，氨基酸在這些區(qū)域的定向突變起到很大作用，同時突變引起包膜蛋白上的N-糖基化位點的糖基化程度和排列的變化也會調(diào)整包膜蛋白的構(gòu)象，對病毒的宿主范圍有重大影響[9]。

本實驗?zāi)c道嗜性毒株和神經(jīng)嗜性毒株的Gp120氨基酸序列結(jié)果顯示，這兩種嗜性毒株在V1和V4區(qū)具有較大差異。有研究表明，V1/V2區(qū)的某些特定氨基酸與小膠質(zhì)細胞合胞體形成有關(guān)，V1區(qū)對病毒在巨噬細胞中進行有效復(fù)制具有重要作用，可以為可能出現(xiàn)神經(jīng)嗜性毒株提供基礎(chǔ)[10]。我們發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)嗜性的毒株V1和V4區(qū)出現(xiàn)的長且集中的氨基酸位點的突變，這種集中的變異并未在腸道嗜性毒株中觀察到，而在蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中，只有V1區(qū)出現(xiàn)了一個β-片層的差別，故V1區(qū)的氨基酸巨大差異可能正是與神經(jīng)嗜性形成相關(guān)的重要區(qū)域。在之前的研究中，V4區(qū)一直被推測為僅作為一種掩蓋物來幫助病毒逃避機體免疫反應(yīng)。我們的結(jié)果顯示，V4區(qū)的氨基酸差異并沒有造成蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，但腸道嗜性的毒株在V4區(qū)417A-T的變異使得該區(qū)域有一個糖基化位點的增加。在SIVmac239 原始毒株和突變的神經(jīng)嗜性毒株上此處沒有糖基化位點，說明該糖基化的出現(xiàn)與腸道嗜性有一定的相關(guān)性。原始的SIVmac239 毒株可引起輕微的腸病癥狀，但391毒株可引起嚴(yán)重的腸道癥狀，所以該位點的A-T的變異造成糖基化位點的增加可能使SIV毒株的腸道嗜性增強。

先期的病毒嗜性研究中均認為V3區(qū)與病毒的嗜性高度相關(guān)[11]，許多結(jié)果表明，要影響病毒的細胞嗜性，一般至少需要3個以上的氨基酸發(fā)生改變，但在某些情況下，一個氨基酸的變化就會影響對一個細胞系的感染[12,13]。Takeuchi Y等人發(fā)現(xiàn)改變HIV-1的分離株，GUN毒株，V3區(qū)311位點脯氨酸為絲氨酸(P-S)就能使該毒株具備感染腦源性成纖維細胞的能力[14]。我們發(fā)現(xiàn)在V3區(qū)兩種嗜性的毒株317位點都有一個N-糖基化位點的增加，兩種嗜性的毒株雖然與SIV mac239原始毒株有六處氨基酸位點的變異，但其中3處變異兩種嗜性毒株完全相同，其余變異位點也具有一定的相似性和交叉性。 所以雖然V3區(qū)的氨基酸變異和糖基化修飾與毒株的嗜性具有很大相關(guān)性，但并非是造成腸道嗜性和神經(jīng)嗜性差異的重要區(qū)域。

Gp120的保守區(qū)和可變區(qū)多個區(qū)域均分布有N-糖基化位點，而糖基化的改變使DC-SIGN在病毒對巨噬細胞的附著中發(fā)生變化，從而建立巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞嗜性，導(dǎo)致神經(jīng)毒性毒株的出現(xiàn)[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)嗜性病毒糖基化位點在C1和C3各出現(xiàn)了一個糖基化位點的缺失，而調(diào)控HIV對大腦毛細血管內(nèi)皮細胞嗜性的序列定位恰恰就包括Env的C1區(qū)部分，該功能域被認為與巨噬細胞嗜性和T細胞嗜性相關(guān)，是病毒通過血管內(nèi)皮細胞，突破血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵。同時在劉克劍等人的研究中，也觀察到腦病毒株在C1區(qū)的糖基化位點缺失現(xiàn)象[2]。本實驗中神經(jīng)嗜性毒株在C1區(qū)同樣也出現(xiàn)糖基化位點的缺失，而在腸道嗜性和SIVmac239原始序列中均無該現(xiàn)象，進一步證實了C1區(qū)這一糖基化缺失與神經(jīng)嗜性形成的相關(guān)性。而C2和C3區(qū)出現(xiàn)的糖基化位點變化，在Fiorella Rossi 等人的研究中提到了C2區(qū)糖蛋白對病毒嗜性的影響作用[16]但C3區(qū)目前沒有提及，所以這兩個區(qū)域糖基化位點的變化及其功能仍有待進一步的研究。這也提示我們，包膜蛋白保守區(qū)的變異可能與具有神經(jīng)侵襲性和神經(jīng)嗜性的猴免疫缺陷病毒的形成相關(guān)，需要引以重視。

綜上所述，SIV病毒在體內(nèi)的變異進化具有一定的趨向性，形成的腸道嗜性和神經(jīng)嗜性毒株其包膜蛋白Gp120的序列具有顯著差異。兩種嗜性毒株Gp120氨基酸序列差異集中在V1和V4區(qū)，而V4區(qū)的糖基化位點增加可能與腸道嗜性的增強相關(guān)。神經(jīng)嗜性毒株在保守區(qū)的糖基化位點變化值得注意，尤其是C1區(qū)的糖基化位點的缺失與神經(jīng)嗜性的形成密切相關(guān)。V3區(qū)作為一個重點與毒株嗜性相關(guān)的區(qū)域，在本研究中發(fā)現(xiàn)它并非是造成腸道嗜性和神經(jīng)嗜性差異的主要區(qū)域。提示我們在今后對病毒嗜性的研究中，不僅要關(guān)注Gp120可變區(qū)發(fā)生的較明顯的氨基酸變化，也要重視在保守區(qū)的個別可引起糖基化修飾位點變化的氨基酸位點。這對今后在AIDS相關(guān)腸病和腦病分子基礎(chǔ)研究中有一定的指導(dǎo)作用。

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