莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠Wnt7a和APC表達(dá)的影響

薛金龍，孫芳玲，劉婷婷，侯虹麗，魏仁平，向本旭，艾厚喜，王玉蘭，張 麗，石淑先，王 文

(1．北京化工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，北京 100029；2．首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥理研究室，北京 100053；3．河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

腦血管病(cerebral vascular diseases，CVD)是危害人類(lèi)健康和生命的三大疾病之一，而缺血性腦血管病(ischemic cerebralvascular disease，ICD)更是占了其中的50%以上。缺血性腦損傷病理機(jī)制復(fù)雜，一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Wnt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖分化的關(guān)鍵途徑，在大腦的可塑性中起至關(guān)重要的作用。此前對(duì)于Wnt信號(hào)通路在神經(jīng)發(fā)生的作用已經(jīng)有了一定的研究，最近研究表明，Wnt 信號(hào)通路在缺血性腦損傷的修復(fù)過(guò)程中和神經(jīng)血管穩(wěn)態(tài)重構(gòu)中作用機(jī)制明顯[1]。Wnt7a是Wnt信號(hào)通路上游重要配體，對(duì)調(diào)解Wnt信號(hào)通路作用關(guān)鍵，并且Wnt7a 可以調(diào)節(jié)加速細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的進(jìn)程，抑制神經(jīng)膠質(zhì)再生[2]。APC是Wnt信號(hào)通路的抑制劑，可以通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路的激活調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化[3]。

中藥山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(cornus offcinalisSieb.et Zucc)的干燥成熟果肉，具有補(bǔ)肝益腎、澀精固脫的作用。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其有效成分山茱萸環(huán)烯醚萜苷進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到單體化合物莫諾苷(morroniside)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能減小局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，增強(qiáng)皮層抗氧化、抗炎和抗凋亡能力[4-9]，并在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)血小板聚集有一定抑制作用[10-13]。我們推測(cè)莫諾苷對(duì)缺血性腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，并且能夠促進(jìn)缺血性腦損傷的神經(jīng)修復(fù)。本文通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究莫諾苷對(duì)缺血性腦損傷大鼠皮層Wnt7a和APC含量的影響，初步探討莫諾苷促進(jìn)缺血性腦損傷后神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠50只，體重250～280 g，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司【SCXK(京)2011-0004】。由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室常規(guī)飼養(yǎng)【SYXK(京)2010-0013】，自由進(jìn)食進(jìn)水，溫度25±1℃，相對(duì)濕度55±5%。

1.2 藥物

莫諾苷：由本室從山茱萸中提取制備，采用高效液相分析，純度約98.5%，蒸餾水溶解配制新鮮溶液。

1.3 試劑和儀器

一抗Anti-APC antibody(批號(hào)：ab40778)，Abcam(香港)；一抗 Anti-Wnt7aantibody(批號(hào)：ab100792)；小鼠抗β-catenin一抗(批號(hào)：TA09)；山羊抗鼠IgG(批號(hào)：ZB-2010)和山羊抗兔IgG(批號(hào)：ZB-2301)，北京市中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

超聲波細(xì)胞破碎粉碎機(jī)：JY92-II型，寧波市新芝科技研究所；臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)：Microfuge 22R，美國(guó)Beckman Coulter公司；電泳儀：Bio-Rad 043BR1549，美國(guó)BIORAD公司；小型垂直電泳槽：1658004，美國(guó)BIORAD公司；高分辨率多模式分子成像系統(tǒng)：Image Station 4000R，美國(guó)Carestream Health公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：Multiskan Spectrum，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備

采用Longa等[14]所介紹的大腦中動(dòng)脈線栓模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)并稍加改進(jìn)。大鼠術(shù)前禁食12 h。10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切開(kāi)右側(cè)頸部，沿胸鎖乳突肌分離肌肉和筋膜，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈。分離右側(cè)頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。于近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，且在頸總動(dòng)脈分岔處結(jié)扎頸外動(dòng)脈。動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在近心端距頸總動(dòng)脈分岔約4 mm處用眼科剪剪一斜行細(xì)小動(dòng)脈切口，將直徑0.28 mm的栓線從頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈約18 mm，此時(shí)栓線已進(jìn)入大腦中動(dòng)脈，到達(dá)大腦前動(dòng)脈起始部，阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血供，造成大腦中動(dòng)脈供血相關(guān)區(qū)的梗死灶。栓塞30 min后緩慢拔出栓線，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組只分離動(dòng)脈結(jié)扎，不插線。

1.4.2 分組及給藥

大鼠蘇醒后提尾時(shí)出現(xiàn)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收屈曲，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，站立時(shí)向?qū)?cè)傾倒等癥狀即為MCAO模型成功。隨機(jī)將MCAO成模大鼠分為：模型組，莫諾苷小、中、大高劑量組(30 mg/kg，90 mg/kg，270 mg/kg)，每組10只。采用灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥7 d。假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水灌胃。

1.4.3 western-blot 分析Wnt7a和APC 蛋白表達(dá)

取新鮮大鼠右側(cè)皮層腦組織裂解提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳(分離膠10%，濃縮膠5%)，每孔加入50 pg蛋白質(zhì)，先恒壓70 V電泳40 min；然后恒壓100 V 電泳至分離膠底部，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1000 稀釋的兔抗大鼠APC 單克隆抗體和1∶500稀釋的兔抗大鼠Wnt7a多克隆抗體，4℃過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min，再加入1∶2000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，以β-actin作為內(nèi)參，將曝光后的圖片導(dǎo)入軟件Quantity One中分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13．0 軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(x±s)表示，組間比較采用ANOVA 方差分析和t 檢驗(yàn)，以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫印跡法觀察莫諾苷對(duì)缺血性腦損傷后Wnt7a表達(dá)的影響

造模后7 d，模型組大鼠大腦皮層Wnt7a蛋白表達(dá)水平比假手術(shù)組升高(P< 0.01)；與模型組相比，莫諾苷大劑量組(270 mg/kg)大鼠大腦皮層Wnt7a蛋白表達(dá)水平升高顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)(圖1，表1)。

圖1 免疫印跡檢測(cè)缺血性腦損傷大鼠皮層Wnt7a表達(dá)

表1免疫印跡法檢測(cè)Wnt7a表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Tab.1The statistical results of Wnt7a expression changed by western blot

注： n=5，Meam±S.E.M. ** P < 0.01與模型組相比； ## P < 0.01，與假手術(shù)組相比。

2.2 免疫印跡法觀察莫諾苷對(duì)缺血性腦損傷后APC表達(dá)的影響

造模7 d后，模型組大鼠大腦皮層APC蛋白表達(dá)水平比假手術(shù)組顯著降低(P< 0.001)；與模型組大鼠相比，莫諾苷小、中、大劑量組(30 mg/kg, 90 mg/kg, 270 mg/kg)大鼠大腦皮層APC蛋白表達(dá)水平均降低顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.001,P< 0.001,P< 0.001)(圖2，表2)。

3 討論

腦卒中有著高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，給社會(huì)和家庭造成巨大負(fù)擔(dān)，研發(fā)有效的治療缺血性腦損傷的藥物至關(guān)重要，也是今后發(fā)展的必然趨勢(shì)。

圖2 免疫印跡檢測(cè)缺血性腦損傷大鼠皮層APC表達(dá)

表2免疫印跡法檢測(cè)APC表達(dá)變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Tab.2The statistical results of APC expression changed by western blot

注：n=5，mean±S.E.M。*P < 0.05，*** P < 0.001與模型組相比；### P < 0.001，與假手術(shù)組相比。

Wnt信號(hào)通路是廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中的信號(hào)通路，是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖分化的關(guān)鍵途徑并且調(diào)節(jié)成年神經(jīng)發(fā)生[15]，并與腦缺血后的神經(jīng)修復(fù)有著密切的聯(lián)系。很有可能作為藥物促進(jìn)腦缺血損傷后神經(jīng)修復(fù)的靶點(diǎn)之一。

在Wnt信號(hào)通路中Wnt7a配體與細(xì)胞膜上的Fzd結(jié)合，聯(lián)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)可以激活Wnt信號(hào)通路[16]。Wnt7a 具有促進(jìn)突觸發(fā)生的作用，在體外對(duì)大腦顆粒細(xì)胞神經(jīng)元培養(yǎng)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Wnt7a 的提高可以通過(guò)軸突微管的重構(gòu)導(dǎo)致軸突的擴(kuò)展和分支；并能促進(jìn)小腦皮層中的小腦粒細(xì)胞和苔蘚纖維之間突觸聯(lián)系成熟[17]。Wnt 7a促進(jìn)皮質(zhì)層神經(jīng)細(xì)胞的分化和前體細(xì)胞的自我更新能力[18]。

在Wnt 信號(hào)通路中，APC蛋白與β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的穩(wěn)定性密切相關(guān)，APC調(diào)節(jié)β-catenin的含量，控制相關(guān)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。APC會(huì)與β-catenin結(jié)合，促使細(xì)胞核內(nèi)β-catenin運(yùn)出，減少β-catenin/TCF結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程。Wnt-7a可誘導(dǎo)APC蛋白從β-catenin細(xì)胞質(zhì)絡(luò)合物上解離[19]。另外，Sierra等[20]研究發(fā)現(xiàn)，APC會(huì)破壞Axin和Gsk-3β組成的降解復(fù)合體，從而促使β-catenin降解。因此作為Wnt信號(hào)通路的抑制劑[21]，APC含量的增加會(huì)抑制Wnt通路激活而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化。

本文采用免疫印跡法檢測(cè)MCAO模型大鼠大腦皮層Wnt7a和APC的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)造模7 d后，模型組大鼠大腦皮層Wnt7a的表達(dá)比假手術(shù)組顯著升高，APC表達(dá)顯著下降，表明MCAO造模后激活了Wnt信號(hào)通路。大量研究表明腦梗死可激發(fā)短暫和微弱的內(nèi)源性代償性修復(fù)機(jī)制[22]，其中Wnt信號(hào)通路被激活很可能是所涉及的修復(fù)機(jī)制之一。李等[23]發(fā)現(xiàn)腦缺血7 d后海馬區(qū)的Wnt7b和β-catenin表達(dá)量均明顯增加，也提示在成年大鼠腦缺血損傷后可內(nèi)源性激活Wnt信號(hào)通路。但腦缺血后短暫的應(yīng)激修復(fù)機(jī)制不足以最終修復(fù)神經(jīng)血管的損傷，需要外源性藥物的干預(yù)治療。我們發(fā)現(xiàn)給予莫諾苷治療7 d后，Wnt7a表達(dá)量較模型組相比明顯上升，APC的表達(dá)則顯著降低，表明莫諾苷很可以通過(guò)促進(jìn)Wnt7a的表達(dá)、抑制APC的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步激活Wnt信號(hào)通路，并進(jìn)一步發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用。由于Wnt通路的調(diào)節(jié)機(jī)制比較復(fù)雜，莫諾苷如何通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)恢復(fù)，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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