近交系小鼠移植性肝癌模型建立及對比分析

李曉娟，湯紫榮，李 蓓，李瑞生

(1．解放軍第302醫(yī)院實驗技術研究保障中心，北京 100039；2．解放軍第302醫(yī)院感染控制科，北京 100039)

肝癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其起病隱匿，病程短，死亡率高，且發(fā)病率還呈逐年上升趨勢[1]。由于肝癌的各種臨床療效不佳，預后不良，因此肝癌的研究已成為臨床和基礎研究的熱點[2]，但肝癌的發(fā)生機制至今仍未完全闡明。而建立理想的肝癌動物模型是研究肝癌發(fā)病機制的重要手段[3]。許多研究者[4-5]復制肝癌模型的小鼠品系不盡相同，而這些不同品系小鼠所建立的肝癌模型成模率、發(fā)病機制是否存在差異，目前還未見評價和報道。因此本實驗選取C57、C3H和BALB/c三種常用的近交系小鼠，利用肝內(nèi)注射的方法建立原位移植性肝癌動物模型，并對其成模效果進行綜合對比分析，以期篩選出一種最佳的品系小鼠，來建立更優(yōu)質(zhì)、更理想的原位移植性肝癌小鼠動物模型，為深入研究肝癌的致病機制提供良好的研究平臺，也為今后肝癌的臨床治療和藥物篩選奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇近交系C3H、C57和BALB/c小鼠，均為SPF級，雄性，各10只，單鼠體質(zhì)量為20～22 g，C3H小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2011-0009】，BALB/c小鼠和C57小鼠購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心【SCXK(軍)2012-0004】。本實驗室具有SPF級實驗動物使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。

1.2 細胞株制備

H22肝癌細胞株來自本實驗室，將H22肝癌細胞株復蘇后腹腔注射小鼠體內(nèi)，8 d后抽取含有肝癌細胞的腹水，離心棄上清，臺盼藍染色計數(shù)，將癌細胞數(shù)調(diào)整至1×108/mL備用。

1.3 實驗分組及肝癌模型制備

將選取的10只C57小鼠作為模型組Ⅰ，10只C3H小鼠作為模型組Ⅱ，10只BALB/c小鼠作為模型組Ⅲ。造模方法：將小鼠麻醉固定，沿胸骨下緣2 cm處沿腹中線向上剪開皮膚約1 cm，暴露肝臟，輕壓腹部擠出肝臟左葉，用注射器吸取H22細胞懸液0.2 mL，刺入肝實質(zhì)內(nèi)，深度約2～3 mm，緩慢注入后撥出針頭，用棉球輕壓注射部位幾秒，然后將肝臟再移回腹腔，縫合切口[6]。術后小鼠均正常飲食。

1.4 形態(tài)學觀察

術后每日觀察各組小鼠的生活狀態(tài)，15 d后處死小鼠，測其腹水量，觀察各組肝臟腫瘤生長情況，并用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積(V)：V=a×b2/2(a為長徑，b為短徑)[7]。將三組小鼠肝臟腫瘤組織置入10%甲醛固定，采用HE染色，并觀察其形態(tài)學。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對模型組Ⅰ、模型組Ⅱ和模型組Ⅲ的腹水量及腫瘤體積進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠肝移植瘤成功率及腹水量對比分析

術后各組小鼠恢復良好，均未出現(xiàn)死亡，存活率均為100%。術后第15天所有小鼠均開腹觀察：模型組Ⅰ的10只小鼠肝臟表面全部有灰白色病灶，腫瘤移植成功率為100%，全部小鼠均產(chǎn)生腹水，腹水量平均為(7.24±1.24)mL。模型組Ⅱ的10只小鼠有6只的肝臟表面有灰白色病灶，腫瘤移植成功率為60%，其中有8只產(chǎn)生腹水，腹水量平均為(6.95±3.45)mL。模型組Ⅲ的10只小鼠僅有3只小鼠的肝臟表面有灰白色病灶，腫瘤移植率為30%，其中有7只小鼠產(chǎn)生腹水，腹水量平均為(6.31±2.75)mL。三組的腹水量之間不存在統(tǒng)計學意義(表1)。

2.2 三組小鼠肝移植瘤外觀的對比分析

模型組Ⅰ的10只小鼠肝臟表面全部有大塊緊實的灰白色結(jié)節(jié)，腫瘤體積平均為(62.21±5.25)mm3。模型組Ⅱ的6只小鼠的肝臟表面有大塊松散的灰白色結(jié)節(jié)，腫瘤體積平均為(43.18±2.47)mm3。模型組Ⅲ的3只小鼠的肝臟表面出現(xiàn)如小米粒大小的灰白色結(jié)節(jié)，腫瘤體積平均為(5.54±1.01)mm3。三組的肝腫瘤平均體積之間均存在顯著的統(tǒng)計學差異(P< 0.05)(表1和圖1)。

2.3 三組小鼠肝移植瘤的組織形態(tài)學分析

模型組Ⅰ和Ⅱ肝臟腫瘤光鏡下可見腫瘤組織呈巢狀，肝小葉組織已經(jīng)完全破壞，腫瘤灶內(nèi)瘤細胞豐富，排列擁擠。瘤細胞異型性明顯，嗜酸性，核分裂像多見。局灶見壞死，瘤細胞間可見裂隙樣血管，部分瘤細胞圍繞血管生長。模型組Ⅲ肝臟腫瘤光鏡下可看到腫瘤細胞與正常細胞交界，腫瘤細胞大小不等，較正常肝細胞體積明顯增大，形態(tài)各異，核大、核膜極不規(guī)則，部分腫瘤組織壓迫周圍肝細胞，癌細胞常常向周圍正常肝組織內(nèi)浸潤性生長(圖2)。

表1 三組小鼠肝癌腫瘤移植成功率、腹水量及腫瘤體積分析

3 討論

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率越來越高，嚴重威脅著人類的健康。目前由于還缺乏有效的治療手段和預防措施，建立一個理想的與人類接近的動物肝癌模型對于研究肝癌的發(fā)病機制有極大的應用價值[8]。而利用小鼠進行肝癌的原位移植能夠很好地模擬人肝癌體內(nèi)的血供和生長環(huán)境，提供與肝癌病人相似的肝癌生物學特性[9]。李銀鵬等[10]利用C57小鼠建立了原位肝癌移植模型并使用高頻超聲技術對小鼠肝原位癌進行可靠的非侵入性監(jiān)測分析。李清等[11]利用BALB/c小鼠研究半乳糖基殼聚糖/5-氟尿嘧啶納米粒來抑制小鼠原位肝癌移植腫瘤，取得了良好地效果。沈艷等[12]對比分析了兩種免疫缺陷動物人肝癌模型的腫瘤生物學特性。本人還曾利用PLCε基因敲除小鼠成功建立了原位移植性肝癌動物模型[13]。但對于這些不同品系小鼠所建立的原位移植性肝癌模型之間是否存在一定的差異和不同，國內(nèi)未見報道。

因此本實驗選取了近交系C3H、C57和BALB/c小鼠復制原位移植性肝癌模型，并對三種小鼠的成模效果進行了對比分析：三種小鼠在實驗過程中均未出現(xiàn)死亡，其存活率為100%，說明該操作方法是可行的。15 d后開腹觀察三組小鼠發(fā)現(xiàn)均產(chǎn)生不同程度的腹水，這與H22為腹水型瘤株基本相符[14]。而不同組小鼠的肝臟外觀顯示：C57組小鼠肝癌移植成功率為100%，顯著高于60%的C3H組和30%的BALB/c組，提示C57小鼠的肝癌成瘤率最高，最易形成原發(fā)性肝癌病灶。同時C57組肝臟腫瘤全部為大塊緊實灰白色病灶，比C3H組和BALB/c組的肝臟腫瘤都大，雖然病理結(jié)果顯示三組小鼠肝臟的灰白色病灶均為典型的肝細胞癌病變，但C57組小鼠的腫瘤平均體積明顯大于后兩組，提示C57小鼠的成瘤效果最好，可利于其來研究原發(fā)性肝癌的發(fā)病機制。這與Ruian Xu等[15]使用C57來復制原位移植性肝癌模型進行相關研究的理念基本一致。而C57小鼠具有最好的成瘤效果可能與該小鼠的遺傳背景和遺傳基因具有相關性，有待進一步對其成瘤機制進行研究和探討。

綜上所述，本實驗針對三種不同小鼠所建立的原位移植性肝癌模型的成模效果進行了綜合分析，證實了C57小鼠是最理想的復制原位移植性肝癌模型的實驗動物，為今后建立原位移植性肝癌模型選擇合適的實驗動物提供了實驗依據(jù)和理論參考，也為進一步研究原位肝癌的發(fā)病機制、臨床治療和藥物篩選提供了研究平臺。

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