胃癌相關(guān)mir-148a靶向調(diào)控胃泌素受體CCKBR

郭水龍，朱圣韜，李 鵬,3，王擁軍,3，王 民，邢 潔，郭慶東，孫秀梅，張澍田,3

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2. 消化疾病癌前病變北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；3.北京市消化疾病中心，北京 100050 )

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤，名列全球第二大癌癥死亡原因[1]。我國是胃癌高發(fā)國，每年新發(fā)胃癌患者40萬人，發(fā)病率在所有惡性腫瘤居首位，死亡人數(shù)達(dá)30萬人，約占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的25%～30%[2]。胃泌素受體(也稱膽囊收縮素B受體，CCKBR)是生長因子胃泌素(Gastrin)的重要受體， 主要分布于在胃體黏膜的壁細(xì)胞和ECL細(xì)胞。生理上，CCKBR主要通過與Gastrin結(jié)合，調(diào)節(jié)胃液、胃蛋白酶和膽汁的分泌[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Gastrin及其受體CCKBR與胃腸道腫瘤尤其是胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，可作為胃癌早期診斷的重要指標(biāo)，并可能發(fā)展成為胃癌治療的靶位點(diǎn)[4-5]。miR-148a是最早發(fā)現(xiàn)，同時(shí)也是最重要的胃癌相關(guān)microRNA之一，但目前對其在胃癌中的作用機(jī)制還不十分明確[6]。本研究從多個(gè)方面證實(shí)miR-148a可以靶向CCKBR，揭示了二者參與胃癌發(fā)生發(fā)展的新的功能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP購自BD公司，miR-148a Luciferase報(bào)告載體pGL3-CM 由pGL3-control改構(gòu)。BGC-823和293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。CCKBR抗體購自Abcom公司，

GAPDH抗體和二抗購自中杉金橋公司。各種限制性內(nèi)切酶和T4多聚核苷酸激酶購自NEB公司。引物和探針合成自Invitrogen公司。質(zhì)粒抽提及凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司，轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 miR-148a靶向CCKBR的生物信息學(xué)預(yù)測：使用microRNA在線靶點(diǎn)分析工具TargetScan(www.targetscan.org)分析人CCKBR基因3’UTR，發(fā)現(xiàn)3處miR-148a的潛在結(jié)合位點(diǎn)，分別位于第334、423和476堿基處(圖1)?？梢钥闯觯琺iR-148a與CCKBR之間存在很好的靶向關(guān)系。

1.2.2 miR-148a真核表達(dá)載體的構(gòu)建：合成miR-148a上下游引物，序列分別為5′- aaaagatctgaacacac ctgcaggaagaa-3′和5′- aaaaaagcttctggcgtctggagcactg-3′，PCR擴(kuò)增出164 bp的產(chǎn)物序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收和連接，插入pIRES2-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒。挑陽性克隆進(jìn)行測序鑒定。

1.2.3 miR-148a過表達(dá)的Northern Blot檢測：miR-148a轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24 h提取細(xì)胞RNA，根據(jù)文獻(xiàn)描述方法進(jìn)行Northern Blot檢測，上樣量為20 μg[7]。 miR-148a探針序列為其完全互補(bǔ)序列，使用T4多聚核苷酸激酶將32P 標(biāo)記5’末端。

1.2.4 熒光素酶活性檢測miR-148a對CCKBR 3’UTR的靶向作用： 使用上下游引物5′-ccgctcgagg gttgaggcagggcaaatgac-3′和5′-ccgacgcgtttgggtaaggaagg agagggc-3′ 擴(kuò)增人CCKBR的3′UTR，并克隆到 pGL3-CM質(zhì)粒構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體(野生型)。采用引物5′-ccggaattcattgttttaga gactatggagc-3′和5′-ccggaattccattaatctatgtgtgtgag agg-3′；5′-ccggaattcaaaa taccatcaggcctaatc-3′和5′-ccggaatt ctgattgggaagggtcactgt -3′；5′-ccggaattcaaaaggttcttcatccct ttcc-3′和5′-ccggaattcagaacagcctgttggtcaga-3′分別將CCKBR 3′UTR的 334、423和476三處miR-148a潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體(突變型)。將報(bào)告載體與miR-148a過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后裂解細(xì)胞，根據(jù)試劑說明書進(jìn)行檢測。檢測儀器為LB 960 Centro XS3 luminometer。

1.2.5 Western Blot蛋白檢測：使用RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白并檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量為25 ～ 50 μg。半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗(1∶1000)4℃孵育過夜，HRP偶聯(lián)二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯影。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 10進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a真核表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1 人CCKBR 3’UTR 上miR-148a結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

將構(gòu)建的miR-148a表達(dá)載體(IE-148a)進(jìn)行測序，結(jié)果顯示 164 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(miR-148a前體)正確插入載體中，序列與pubmed數(shù)據(jù)庫完全一致。Northern Blot檢測miR-148a載體在BGC-823細(xì)胞中的表達(dá)(圖2)，與空載體Vector相比，過表達(dá)組miR-148a的表達(dá)量明顯增加，證實(shí)構(gòu)建的載體能夠在真核細(xì)胞中過表達(dá)miR-148a，適合下一步實(shí)驗(yàn)使用。

圖2 Northern Blot 檢測miR-148a真核載體表達(dá)

2.2 miR-148a通過與3’UTR 423 bp處的靶位點(diǎn)結(jié)合，抑制人CCKBR基因的表達(dá)

熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示(圖3)，miR-148a過表達(dá)可以明顯抑制含CCKBR 3’UTR報(bào)告載體的熒光素酶活性，大約為空載體對照組的64%(P< 0.05)，表明miR-148a通過結(jié)合3’UTR區(qū)可抑制CCKBR基因的表達(dá)。當(dāng)分別將三個(gè)預(yù)測的miR-148a結(jié)合位點(diǎn)突變后，3’UTR 423 bp處的突變可顯著消除miR-148a過表達(dá)導(dǎo)致的熒光素酶活性降低(P> 0.05)。而3’UTR 334 bp和476 bp處的結(jié)合位點(diǎn)突變沒有此效應(yīng)(P< 0.05)，與野生型報(bào)告載體的熒光素酶活性相同。結(jié)果表明，miR-148a通過與CCKBR 3’UTR 334 bp處結(jié)合，直接抑制該基因的表達(dá)。

圖3 熒光素酶活性分析檢測各組報(bào)告載體表達(dá)(*P < 0.05)

2.3 miR-148a抑制CCKBR蛋白表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示，如圖4，與空白對照和空載體Vector相比，miR-148a過表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞BGC-823中CCKBR的蛋白表達(dá)。

圖4 Western Blot檢測各組細(xì)胞CCKBR蛋白表達(dá)

3 討論

胃泌素主要由分布于胃竇和十二指腸近端的G細(xì)胞分泌，通過與受體結(jié)合調(diào)節(jié)胃酸和組胺的分泌來發(fā)揮作用。胃泌素在胃中作用的主要靶點(diǎn)是胃體黏膜的壁細(xì)胞和腸嗜鉻樣細(xì)胞(ECL)細(xì)胞表面分布的受體CCKBR。小鼠胃CCKBR基因敲除導(dǎo)致ECL細(xì)胞減少，胃壁變薄[8]。近年來胃泌素及其受體CCKBR在消化道腫瘤及其癌前病變中的作用越來越引起人們重視。研究證實(shí)，胃癌患者胃癌組織中CCKBR的含量明顯高于對照正常組織，胃泌素及CCKBR廣泛參與胃癌發(fā)生發(fā)展[4,9-10]。Cui等[11]發(fā)現(xiàn)高胃泌素血癥的日本綿鼠發(fā)生胃癌，該胃癌起源于ECL細(xì)胞，而CCKBR拮抗劑YF476可阻止高胃泌素引起的胃癌發(fā)生[12]。雖然CCKBR在胃癌發(fā)展過程中表達(dá)逐漸升高，但其異常表達(dá)的機(jī)制至今不是十分明確。

microRNA (miRNA)是一類22 bp左右的非編碼小RNA，通過序列互補(bǔ)與特異mRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。我們前期的工作和眾多研究組研究結(jié)果表明，miR-148a在人胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，并通過作用于不同的靶分子調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等[13-17]，是重要的胃癌抑制miRNAs之一。我們前期對miR-148a在胃黏膜中的表達(dá)定位研究結(jié)果顯示，miR-148a主要分布于小鼠胃黏膜底部，這一位置主要為壁細(xì)胞和ECL細(xì)胞等分泌細(xì)胞，提示miR-148a可能參與調(diào)控胃黏膜的分泌功能[14]。此外，我們前期研究還發(fā)現(xiàn)，miR-148a下調(diào)是胃癌發(fā)生的早期事件，胃癌小鼠模型胃組織中miR-148a在小鼠出生20 d后即觀察到50%的下調(diào)，60 d后下調(diào)約80%[18]，這與胃癌發(fā)展過程中CCKBR的逐漸上升是同步的，提示二者之間可能存在調(diào)控關(guān)系。本研究中，我們首先通過信息學(xué)預(yù)測，在CCKBR中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)miR-148a的結(jié)合位點(diǎn)。然后，通過構(gòu)建的miR-148a真核表達(dá)載體并在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)，我們證明miR-148a可直接與CCKBR的3’UTR結(jié)合，抑制其基因表達(dá)和蛋白翻譯。這一發(fā)現(xiàn)，為CCKBR表達(dá)調(diào)控機(jī)制和miR-148a在胃癌中的作用機(jī)制提供了新的解釋。

目前，國內(nèi)外研究者都在開發(fā)新的胃癌早期診斷標(biāo)志物和藥物作用靶點(diǎn)，而胃泌素及其受體和miRNA是其中的兩大熱點(diǎn)[9,19-21]。本研究的結(jié)果為胃癌早期篩查和治療提供了新的潛在靶分子，并為下一步的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

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