當歸多糖對腦梗死大鼠血腦屏障通透性影響及MRI評價

夏旺旭，徐 露

(1.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院 放射科，重慶 400012 ； 2.重慶醫(yī)科大學 生化與分子藥理學重點實驗室 ，重慶 400016)

腦梗死是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，其在老年人群體中發(fā)病率和致死率較高，嚴重威脅著廣大老年人的健康，并給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。腦梗死后神經(jīng)細胞代謝紊亂，血腦屏障 (blood-brain barrier，BBB)發(fā)生破壞，使得通透性增加，發(fā)生腦水腫[1]。已有研究表明BBB的破壞將加重腦組織的缺血損傷[2]。當歸多糖(Angelica polysaccharide)是傘形科植物當歸(Angelica sinensis)的主要有效成分，具有促進血液循環(huán)、抗炎及增強免疫力等作用。由于當歸多糖在神經(jīng)系統(tǒng)的研究較少，而其活血化瘀作用在腦梗死等疾病中有重要的意義，因此本研究利用大鼠MCAO模型，檢測大鼠腦梗死24 h后，當歸多糖對腦梗死大鼠BBB及Claudin-5和ZO-1變化，并進行MRI評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 健康雄性SD大鼠50只，體質量(250±10)g，由中國醫(yī)科大學動物中心提供。當歸多糖購自陜西慈緣生物技術有限公司，純度98%。大鼠隨機分成 5組：假手術組、腦梗死組、當歸多糖高劑量組(200 mg/kg)、當歸多糖中劑量組(100 mg/kg)、當歸多糖低劑量組(50 mg/kg)，在模型建立前灌胃給藥，每日1次，連續(xù)3 d。claudin-5、ZO-1和 β-actin 抗體購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦梗死模型制備 參照文獻[3]，采用大腦中動脈線栓法制作局灶性腦缺血模型。大鼠麻醉后，切開頸中部皮膚，分離右側頸總動脈，再分離出頸內、頸外動脈，并結扎翼腭及頸外動脈。將4-0尼龍魚線從頸總動脈遠端切口處插入頸內動脈約18～22 mm，從而阻塞大腦中動脈近端血流。假手術組魚線則進入到頸動脈分叉處即可。大鼠醒后，參照Longa等[4]的方法進行神經(jīng)功能缺損評分，1～3分的動物選為實驗動物。

1.2.2 BBB的通透性測定 采用伊文思藍(Evans blue，EB)滲透法分析BBB通透性變化[5]。腦梗死24 h后，每組取5只大鼠尾靜脈注射2%EB 0.5 mL。0.5 h后，麻醉大鼠，用肝素化的生理鹽水進行心臟灌流，直到右心房流出清澈液體后再斷頭。取出的腦組織稱重，浸入甲酰胺(1 mL/100 mg)中，置于60 ℃水浴箱內孵育24 h。分光光度計檢測波長為620 nm，根據(jù)制的EB標準曲線，分析腦組織中EB的含量。

1.2.3 Western blot 檢測 各組剩余5只大鼠迅速斷頭取腦，提取腦缺血區(qū)皮層組織加入裂解緩沖液，于4 ℃，以17 000 r/min轉速離心15 min，取上清。采用 BCA法測定蛋白濃度。各組取25 μL蛋白上樣，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。再用5%脫脂奶粉封閉2 h，再分別與稀釋500倍的claudin-5、ZO-1抗體在4℃下孵育過夜，室溫下再與二抗孵育2 h，ECL法顯色，β-actin為內對照。凝膠成像系統(tǒng)對膠片掃描后，用Fluor Chen 2.0軟件進行分析，得到條帶的整合光密度值(integrated density value，IDV)。

1.2.4 MRI檢查 采用西門子1.5T MRI儀，在大鼠頭部套上專用線圈(QD)。于腦梗死24h后對大鼠頭顱進行T2WI檢查，觀察梗死部位及周邊的T2WI顯示的信號強度及體積。

2 結果

2.1 當歸多糖對腦梗死大鼠腦腦缺血24 h EB含量的影響 模型組及當歸多糖各組腦梗死24 h后腦組織中EB含量均較假手術組顯著增多(P<0.01)；當歸多糖各組EB含量均顯著低于模型組(P<0.01，P<0.05，見表1)。

組別給藥量EB含量(μg/g)假手術組相應容積NS0.50±0.11模型組相應容積NS4.89±0.36*當歸多糖高劑量組 200mg/kg2.96±0.15*#當歸多糖中劑量組 100mg/kg3.10±0.20*#當歸多糖低劑量組 50mg/kg3.21±0.22*#

與假手術組相比*P<0.01，與模型組相比#P<0.01。

2.2 Claudin-5及ZO-1蛋白表達水平 與假手術組相比較，模型組和當歸多糖各組在24 h時間點，Claudin-5和ZO-1蛋白表達水平顯著下降(P<0.01)。而當歸多糖各組Claudin-5和ZO-1蛋白表達水平均顯著高于模型組(P<0.05,P<0.01,見圖1，表2)。

A:假手術;B:模型;C:當歸多糖高劑量;D:當歸多糖中劑量;E:當歸多糖低劑量。圖1 各實驗組Claudin-5及ZO-1蛋白表達wb圖

2.3 腦梗死大鼠T2WI掃描檢測梗死體積比較 T2WI掃描檢測到假手術組未見梗死灶。當歸多糖各組梗死體積與模型組相比，顯著縮小，有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖2，表3)。

組別 給藥量 Claudin-5 ZO-1假手術組相應容積NS0.928±0.045#0.799±0.030模型組相應容積NS0.404±0.038*0.245±0.021*當歸多糖高劑量組200 mg/kg0.645±0.041*#0.496±0.036*#當歸多糖中劑量組100 mg/kg0.642±0.039*#0.483±0.033*#當歸多糖低劑量組50 mg/kg0.637±0.036*#0.475±0.030*#

與假手術組相比*P<0.01,**P<0.05，與模型組相比#P<0.01。

A：假手術組；B：模型組；C：當歸多糖高劑型組；D：當歸多糖中劑型組；E:當歸多糖低劑型組。圖2 腦梗死大鼠T2WI掃描圖片

組別給藥量T2WI(V/mm3)假手術組相應容積NS0模型組相應容積NS472.8±33.2*當歸多糖高劑量組200 mg/kg304.5±20.1*#當歸多糖中劑量組100 mg/kg315.9±23.4*#當歸多糖低劑量組50 mg/kg310.7±22.8*#

與假手術組相比*P<0.01，與模型組相比#P<0.01。

3 討論

在腦梗死的發(fā)生和發(fā)展過程中，血腦屏障的破壞是腦梗死損傷早期的重要病理生理變化[6]。在腦缺血發(fā)生的情況下，炎癥因子表達增高，氧自由基和蛋白水解酶大量表達，引起腦微血管內皮細胞發(fā)生破壞，BBB結構破壞，通透性增加[7]。由于BBB通透性增加，使得有毒有害物質大量入腦，從而造成水腫和新的損傷[8]。EB實驗是檢測血腦屏障通透性的重要方法。正常情況下EB由于分子量大不能通過BBB，但在BBB受損的情況下，EB能順利通過BBB[5]。通過檢測腦組織中EB的含量可以反應出BBB受損的情況。通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)當歸多糖高、中、低劑量組腦組織中的EB含量顯著低于模型組，說明當歸多糖對BBB有一定的保護作用。

緊密連接蛋白(TJ)是維持腦微血管內皮細胞形態(tài)和結構的重要物質[9]。緊密連接蛋白包括Claudin-5、ZO-1、Occludin等。緊密連接蛋白表達降低，反應出BBB結構破壞嚴重[10]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)當歸多糖各組能明顯增加緊密連接蛋白Claudin-5及ZO-1的表達，說明當歸多糖能降低緊密連接蛋白的降解情況，減輕BBB的破壞程度，這與當歸多糖降低BBB通透性結果相一致。

在腦梗死的研究中，MRI技術在腦梗死的診斷及療效分析中起到重要作用[11]。本研究通過MRI技術測定了腦梗死大鼠的腦梗死體積，發(fā)現(xiàn)當歸多糖能顯著降低腦梗死大鼠的梗死體積，這與當歸多糖降低BBB的破壞有重要的聯(lián)系。

綜上所述，當歸多糖能顯著減輕腦梗死大鼠的BBB破壞程度，降低BBB的通透性，從而減輕大鼠的腦梗死體積，具有重要的腦保護作用。在3個劑量的當對多糖組中，當歸多糖高劑量的各指標數(shù)值最接近于假手術組，說明高劑量的當歸多糖對BBB的保護作用更為顯著，可能當歸多糖對BBB的保護作用具有一定的量效關系。針對當歸多糖的這個新的發(fā)現(xiàn)，證明其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有一定的潛力，值得進一步地研究和開發(fā)。

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