吡那地爾后處理對缺血/再灌注大鼠離體心臟超微結(jié)構(gòu)的影響

王 穎，張永國，侯偉波，王海英，喻 田

(遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉系， 貴州 遵義 563099)

經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)、冠脈搭橋術(shù)雖能使缺血心肌重新獲得血流供應(yīng)而挽救生命，但伴隨著強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重心臟損傷，即為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。吡那地爾為吡啶氰胍類非選擇性鉀通道開放劑，能預(yù)防和減輕心肌缺血癥狀，縮小心肌梗死面積[1-3]，對缺血再灌注心肌起到保護(hù)作用。本研究通過采用langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)，從微觀角度觀察，吡那地爾后處理對缺血/再灌注離體大鼠心臟的超微結(jié)構(gòu)及線粒體評分的影響，為深入研究吡那地爾后處理心肌保護(hù)機(jī)制提供依據(jù)，為臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 年齡為15～18周健康雄性SD大鼠，250～300g，8～9周齡，清潔級(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)學(xué)院動物中心提供，證書號：SCXK(渝)2012-0005)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 吡那地爾(Sigma公司，美國)；Krebs-Henseleit灌注液(K-H液)：(單位 mmol /L)NaC1 118.0、KC1 4.7、KH2P041.2、MgSO41.2、NaHCO325.0、CaC121.25、Glucose 10.0；Tomas停跳液：(單位 mmol /L) NaC1 118.0、KC1 4.7、NaHCO325.0、CaC121.25、MgCl2·6H20 219.08(國產(chǎn)分析純)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 BS224S 電子天平(sartorius公司，德國)；去離子水處理器(Milli QA，美國)；CyberScan 310型pH計(jì)(優(yōu)特EUTECH 新加坡公司，美國)；powerlab生物信號采集系統(tǒng)、langendorff 離體心臟灌注系統(tǒng)(澳大利亞)；透射電子顯微鏡(日立H7500日本)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建立模型 將麻醉后(肝素 250/kg、1%戊巴比妥鈉 40 mg /kg，腹腔)大鼠固定，迅速開胸取心臟置于K-H液中(4 ℃，pH 7.35～7.45)，排除血液，固定主動脈于Langendorff灌注針，充氧后K-H液(37 ℃，pH 7.35～7.45)持續(xù)逆行灌注，剪開肺動脈降低肺動脈壓，去除左心耳，將球囊傳感器沿左心房插入左心室固定，調(diào)整灌注壓在70～80 mmHg，左室舒張末壓在4～8 mmHg，平衡20 min后，心率>250次/min、左室發(fā)展壓≥80 mmHg、室性早搏≤2個/min，建模成功。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組 將24個成功模型隨機(jī)分為4組，每組6只：正常組(N) 持續(xù)K-H液灌注120 min；缺血/再灌注組(I/R) K-H液20 min，缺血40 min，再灌注60 min；缺血后處理組(IPO) K-H液20 min，缺血40 min，缺血與再灌注10s反復(fù)交替2 min，再灌注58 min；吡那地爾后處理組(Pi) K-H液20 min，缺血40 min，Pi 2 min，再灌注58 min。

1.4.3 制備電鏡標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取左心室不同部位組織，將其切為1×1×1(mm)大小，取5～8塊置于含有2.5%戊二醛固定液的EP管中(4 ℃)，以上操作需在2 min內(nèi)完成。4 ℃冰箱固定2h，進(jìn)行固定、脫水及包埋，將超薄切片置于透射電子顯微鏡下觀察10個視野并拍照。

1.4.4 線粒體評分 每個電鏡標(biāo)本隨機(jī)選擇5個視野，每個視野隨機(jī)選擇20個線粒體，使線粒體總數(shù)達(dá)100個，采用Flameng評分標(biāo)準(zhǔn)[4](見表1)，將觀察到的每個線粒體損害程度按0～4級，分別計(jì)為0～4分，最后將100個線粒體所得總分除以100，既為該標(biāo)本得分，分?jǐn)?shù)越高，表示線粒體損傷越重。

表1線粒體Flameng評分標(biāo)準(zhǔn)

分級線粒體損害程度評分0級線粒體結(jié)構(gòu)正常,充滿顆粒0分1級線粒體結(jié)構(gòu)正常,但顆粒缺乏1分2級線粒體腫脹,基質(zhì)透明2分3級線粒體嵴分裂,伴基質(zhì)透明和濃聚3分4級基質(zhì)丟失,線粒體嵴分裂,線粒體4分內(nèi)膜和外膜完整性缺失,呈空泡狀

2 結(jié)果

2.1 超微結(jié)構(gòu) 各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變(見圖1)，N組心肌細(xì)胞(見圖1A)結(jié)構(gòu)完整，肌絲排列整齊，可見Z線、M線清晰，胞漿中富含球形、卵圓形線粒體，脊密集，排列整齊。I/R組心肌細(xì)胞(見圖1B)損害嚴(yán)重，可見細(xì)胞內(nèi)外明顯水腫，核膜破裂，肌絲大面積溶解，Z線溶解，線粒體腫脹，脊斷裂、溶解呈空泡樣變，肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。IPO組、Pi組心肌細(xì)胞(見圖1C、圖1D)損害較I/R組輕，可見肌絲稀疏，部分溶解，排列基本整齊，線粒體結(jié)構(gòu)完整，部分輕度腫脹，脊排列整齊。

A: N組；B: I/R組；C: IPO組；D: Pi組。圖1 各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(標(biāo)尺2μm，× 20000)

2.2 線粒體評分 采用線粒體Flameng評分法，對各組大鼠心肌組織線粒體評分，結(jié)果顯示(見表2)

分組線粒體評分N0.220±0.042I/R3.760±0.043*IPO1.280±0.045*&Pi1.210±0.041*&#

與N組比較*P<0.05，與I/R組比較&P<0.05，與IPO組比較#P=0.247。

3 討論

線粒體是心肌細(xì)胞氧化功能的主要場所，當(dāng)心臟發(fā)生缺血/再灌注時，線粒體可產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，使線粒體膜磷脂、呼吸鏈蛋白產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化損傷，導(dǎo)致氧化磷酸化障礙，造成線粒體結(jié)構(gòu)及功能損傷，從而損害心肌。心臟缺血后處理可維護(hù)線粒體膜內(nèi)部的完整和線粒體膜電位的穩(wěn)定、減少線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，保護(hù)線粒體呼吸鏈功能，從而減輕心肌缺血再灌注損傷[5-6]。ATP敏感性鉀通道對實(shí)現(xiàn)上述細(xì)胞保護(hù)作用至關(guān)重要，用線粒體ATP敏感性鉀通道阻斷劑可廢除上述心肌保護(hù)效應(yīng)[7-9]。吡那地爾為吡啶氰胍類非選擇性鉀通道開放劑，可同時開放線粒體ATP敏感性鉀通道及細(xì)胞膜ATP敏感性鉀通道，改善缺血心臟功能。本課題組前期通過檢測基因表達(dá)，采用RT-PCR及Western blotting法，觀察到吡那地爾后處理可模擬缺血后處理對離體心臟灌注的心功能產(chǎn)生一定的保護(hù)作用[10-11]，50μmol/L為吡那地爾產(chǎn)生心肌保護(hù)作用最佳濃度。

本研究結(jié)果顯示，電鏡下N組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，I/R組心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞明顯水腫，核膜破裂，肌絲大面積溶解，Z線溶解，線粒體腫脹，脊斷裂、溶解呈空泡樣變，肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。IPO組及Pi組心肌細(xì)胞損傷程度相似，均介于N組與I/R組之間。4組心肌細(xì)胞進(jìn)行線粒體評分，可見N組明顯低于I/R組，IPO組及Pi組評分相似，且均介于N組與I/R組之間。說明IPO組及Pi組對心肌缺血/再灌注損傷均有保護(hù)作用，且吡那地爾后處理避免了缺血后處理反復(fù)鉗夾血管等不利因素，可操作性強(qiáng)，因此，吡那地爾后處理可能具有更好的優(yōu)勢。

綜上所述，本研究從細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面證實(shí)了缺血后處理及吡那地爾后處理可減輕缺血/再灌注所致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損害，降低線粒體評分，可能產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。

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