蟲(chóng)草菌高附加值活性次生代謝產(chǎn)物的多樣性及二次性開(kāi)發(fā)利用

肖建輝

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院暨貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

蟲(chóng)草，非指蟲(chóng)與草，而是蟲(chóng)與菌，亦是蟲(chóng)草屬Cordyceps (Frey) Link中所有真菌的統(tǒng)稱(chēng)。其中冬蟲(chóng)夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.(=Ophiocordyceps sinensis)是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴珍稀滋補(bǔ)中藥材，應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)，頗受華人青睞。應(yīng)用蟲(chóng)草的最早文字記載，可追溯到1300余年前唐代《月王藥診》和《藏本草》，稱(chēng)其“潤(rùn)肺、補(bǔ)腎”。近20余年來(lái)，蟲(chóng)草已成為國(guó)內(nèi)外生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)話(huà)題[1]。

蟲(chóng)草菌物種豐富多樣。英國(guó)CABI databases登載的蟲(chóng)草菌有500余種(http://www.speciesfungorum.org)。排除同物異名因素，學(xué)術(shù)界公認(rèn)的蟲(chóng)草物種約400種[2-3]，其中我國(guó)報(bào)道了近100種[4]。在這數(shù)百種蟲(chóng)草菌中，冬蟲(chóng)夏草與人參、鹿茸齊名，位居我國(guó)3大名貴滋補(bǔ)中藥之首。遺憾的是，這種聲名深刻影響了冬蟲(chóng)夏草資源的可持續(xù)利用。一方面該物種野生資源數(shù)量受自身生物學(xué)特性嚴(yán)格限制，而規(guī)?；斯ぴ耘嗥裆形磳?shí)現(xiàn)，供給極其有限；另一方面，人民生活水平提高及中醫(yī)藥歷史文化影響，市場(chǎng)需求旺盛。從而導(dǎo)致近10年來(lái)冬蟲(chóng)夏草價(jià)格飆升，賽過(guò)黃金。更嚴(yán)重的是，長(zhǎng)期以來(lái)受利益驅(qū)動(dòng)，人們無(wú)序、掠奪式采挖，使本來(lái)脆弱的、冬蟲(chóng)夏草賴(lài)以生存的生態(tài)環(huán)境遭受毀滅性破壞，野生資源瀕臨枯竭[3-4]，已成為制約蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。冬蟲(chóng)夏草真的有出神入化的功效嗎？現(xiàn)代中藥化學(xué)的研究結(jié)果并無(wú)重要發(fā)現(xiàn)，使一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者不得不懷疑[5]。不過(guò)，作為一種食用了千余年的名貴中藥，其藥性是不容質(zhì)疑的。也許是我們尚未發(fā)現(xiàn)它為什么和怎樣發(fā)揮功效的科學(xué)證據(jù)，而這涉及到蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)的未來(lái)發(fā)展方向。目前蟲(chóng)草制品主要是原料級(jí)生藥或一次性粗制品，而市場(chǎng)鮮見(jiàn)高技術(shù)高附加值二次性產(chǎn)品，蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)亟待轉(zhuǎn)型升級(jí)。另外，冬蟲(chóng)夏草已成瀕危物種?；谏飬f(xié)同進(jìn)化理論，我們是否能在400多個(gè)蟲(chóng)草物種中，找到冬蟲(chóng)夏草的替代資源或者更具研發(fā)潛力的新資源？大量的研究表明，許多蟲(chóng)草物種具有替代冬蟲(chóng)夏草潛力，它們有類(lèi)似的化學(xué)成分和藥理作用[4,6]，乃至存在冬蟲(chóng)夏草不具有的新物質(zhì)與新功效。

綜上所述，基于讓人們更好地認(rèn)識(shí)蟲(chóng)草資源未來(lái)深度開(kāi)發(fā)利用的方向，本文擬評(píng)述蟲(chóng)草高附加值活性物質(zhì)多樣性的進(jìn)展，為該類(lèi)資源深度開(kāi)發(fā)利用提供新思路。

1 蟲(chóng)草活性次生代謝物的多樣性

蟲(chóng)草菌與寄主昆蟲(chóng)或節(jié)肢動(dòng)物的關(guān)系，寄生或共生？迄今仍存爭(zhēng)議[7]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，為克服入侵時(shí)寄主的天然屏障，以及逃避侵入后寄主的免疫監(jiān)控，達(dá)成與寄主的生活史同步化，最終完成自身細(xì)胞增殖、分化和整個(gè)生活史。在這個(gè)過(guò)程中，生成了與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、應(yīng)激保護(hù)相關(guān)的，具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣、生物功能多樣和作用多靶點(diǎn)等特點(diǎn)的“功能性”活性代謝物[6, 8]，并彰顯具創(chuàng)制藥物的巨大潛力[6, 8-9]。近些年來(lái)，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)蟲(chóng)草原料或粗提物的一次性直接利用，應(yīng)該逐步過(guò)度到更高層次二次性化學(xué)成分的研發(fā)，即化學(xué)成分與藥理作用點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的研究。由此，蟲(chóng)草次生代謝產(chǎn)物的研究日益成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)已報(bào)道的代謝產(chǎn)物主要可概括為以下幾大類(lèi)：

1.1 生物堿類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 早在1950年，Cunningham等在蛹蟲(chóng)草菌中分離到一種抗菌的代謝產(chǎn)物，定名為蟲(chóng)草素(cordycepin)，化學(xué)名為3’-脫氧腺苷(C10H13N5O3)，并發(fā)表在Nature雜志上。隨后數(shù)10年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蟲(chóng)草素的來(lái)源、生物高效合成與分離制備，人工合成與修飾、藥理活性及作用機(jī)制等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明，蟲(chóng)草素不僅有明顯的抗菌、抗病毒和殺蟲(chóng)功效[10-12]，還有顯著的抗腫瘤作用[13]，是一種廣譜抗生素。遺憾的是，肌體內(nèi)腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)可使蟲(chóng)草素脫氨，而生成3’-脫氧次黃嘌呤核苷，活性顯著降低，使其成藥性受到極大挑戰(zhàn)。所幸的是，ADA抑制劑可延緩蟲(chóng)草素在體內(nèi)的代謝，給其臨床應(yīng)用帶來(lái)了轉(zhuǎn)機(jī)[14]。Furuya等[4]在粉被蟲(chóng)草中，首次發(fā)現(xiàn)了生物來(lái)源的Ca2+拮抗劑，命名為N6-(2-羥乙基)腺苷(C12H17N5O5, N6-(2-hydroxyethyl)adenosine)。

吡啶酮類(lèi)化合物是近些年報(bào)道的一類(lèi)新的活性生物堿，有一定的抗腫瘤細(xì)胞毒活性。Isaka等[15]自C. nipponica菌中分離獲得N-羥基及N-甲氧基吡啶酮，命名為cordypyridones A-D(見(jiàn)圖1)。其中N-羥基吡啶酮cordypyridones A和B(C16H23NO3)是同分異構(gòu)體，均有顯著抗瘧原蟲(chóng)活性，IC50值分別是0.066、0.037 μg/mL，但其抗腫瘤細(xì)胞毒性較弱。之后，德國(guó)學(xué)者Schmidt等[16-17]在蛹蟲(chóng)草菌中發(fā)現(xiàn)了吡啶酮生物堿militarinone A(C26H37NO6)和D(C26H31NO4)，以及3-?；陌匪?tetramic acid) militarinone B(C26H33NO5)和C (C26H33NO4,圖1)，并認(rèn)為militarinones C、B、D是A生物代謝合成途徑的中間體。細(xì)胞毒活性結(jié)果提示，militarinone D對(duì)PC-12細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用，而militarinones A、B和C沒(méi)有細(xì)胞毒效應(yīng)或不明顯。有趣的是，Cheng等[18]自蟲(chóng)花棒束孢Paecilomyces farinosus (異名又稱(chēng)Isaria farinosa)中分離獲得的脫氧militarinone A(C26H37NO5, 圖1)，對(duì)人神經(jīng)元IMR-32細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。Cheng等[19]還從該菌中分離到兩個(gè)新的吡啶酮生物堿farinosone A (C25H27NO4)和B (C25H27NO5)，以及吡啶酮生物合成途徑的中間體farinosone C (C19H25NO5, 圖1)，這幾個(gè)化合物對(duì)PC-12細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒效應(yīng)。但是，Lang 等[20]從蟲(chóng)花棒束孢中分離獲得兩個(gè)化合物，farinosone B和一個(gè)新的四胺酸(tetramic acid)衍生物paecilosetin(C22H31NO4, 圖1)。它們對(duì)小鼠白血病P388細(xì)胞均有明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)。近來(lái)，Che研究組[21]從冬蟲(chóng)夏草定殖真菌蟲(chóng)花棒束孢Isaria farinosa中也分離到militarinones A和B，并獲得兩個(gè)新的N-羥基吡啶酮militarinones E和F，兩個(gè)新苯腙化合物farylhydrazones A和B，以及一個(gè)新喹唑酮化合物2-(4-hydroxybenzyl)quinazolin-4(3H)-one(見(jiàn)圖1)。活性檢測(cè)的結(jié)果提示，militarinones A和E對(duì)肺癌A549細(xì)胞有顯著的抗腫瘤細(xì)胞毒活性，而militarinones B呈現(xiàn)抗菌活性。這與Schmidt等報(bào)道m(xù)ilitarinones A未檢測(cè)到其明顯的細(xì)胞毒性不一致，可能與選擇的細(xì)胞株有關(guān)。因此，militarinones A對(duì)腫瘤細(xì)胞可能存在選擇毒性。

不僅蟲(chóng)花棒束孢含有豐富的生物堿類(lèi)物質(zhì)，也從其它蟲(chóng)草棒束孢發(fā)現(xiàn)許多有潛在價(jià)值的生物堿。細(xì)腳棒束孢Isaria tenuipes(又稱(chēng)高雄山蟲(chóng)草菌)是在東南亞利用比較廣的一種蟲(chóng)草菌。Isaka研究組[22-23]先后從細(xì)腳棒束孢兩個(gè)菌株中獲得6個(gè)新生物堿isariotins A-F (見(jiàn)圖1) 和一個(gè)已知化合物TK-57-164A。其中isariotins A-D帶獨(dú)特的雙環(huán)[3.3.1]壬烷環(huán)，而isariotins E和F帶有螺環(huán)或雙環(huán)半縮醛。Isariotins F有良好的抗惡性瘧原蟲(chóng)Plasmodium falciparum K1活性(IC50=5.1μM)，且對(duì)乳腺癌BC細(xì)胞和肺癌NCI-H187細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒活性，其IC50分別為2.4和1.6μM。日本棒束孢Isaria japonica(或日本蟲(chóng)草C. japonica)，也稱(chēng)叫大孢蟲(chóng)花，其在日本廣為利用。Lee研究組[24]從該蟲(chóng)草菌中分離到一種新的嗎啉衍生物(3R,6R)-4-甲基-6-(1-甲基乙基)-3-苯基甲基全氫化-1,4-噁嗪-2,5-二酮(C15H19NO3，圖1中化合物1) 和兩種已知的嗎啉衍生物lateritin與bassiatin，并發(fā)現(xiàn)這個(gè)新的化合物能誘導(dǎo)人白細(xì)胞HL-60細(xì)胞凋亡。另外，Chou研究組[25]從蟬花上也分離到bassiatin，并第1次獲得天然來(lái)源的bassiatin A (見(jiàn)圖1)。

另外，Isaka研究組[26]從Cordyceps brunnearubra BCC 1395菌中獲得青黃霉素類(lèi)生物堿cordyformamide，可能是青黃霉素 Y2的前體物，有中等抗瘧原蟲(chóng)活性，但無(wú)細(xì)胞毒作用。最近，Yang等[27]在發(fā)掘冬蟲(chóng)夏草菌抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)過(guò)程，分離鑒定了50次生代謝物，其中5個(gè)新化合物命名為cordysinin A, B, C, D和E (見(jiàn)圖1)，僅cordysinin A有較弱的抗炎活性。但45個(gè)已知化合物中，發(fā)現(xiàn)生物堿perlolyrine(1-(5-Hydroxymethyl-2-furyl)-β-carboline，C16H12N2O2)有顯著的抗炎潛力。

1.2 多肽類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 小分子多肽是藥物研發(fā)關(guān)注的熱點(diǎn)之一，它在肌體內(nèi)有清除率高、半衰期短，且毒副作用小等特點(diǎn)。上世紀(jì)60年代末，Hamill等 (1969) 在昆蟲(chóng)病原真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana中獲得一種強(qiáng)殺蟲(chóng)活性的環(huán)己縮酚，命名為肽白僵菌素(Beauvericin，C45H57N3O9, 圖2)。之后，在蟬花、高雄山蟲(chóng)草等多種蟲(chóng)草菌中分離到白僵菌素[25, 28-29]。Chou研究組[25]在蟬花中還獲得兩種白僵菌素的衍生物beauvericins A和B。白僵菌素可作為細(xì)胞內(nèi)的離子載體，而對(duì)胞內(nèi)電解質(zhì)與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起調(diào)節(jié)作用[30]，其還有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[28,31]。白僵菌素的抗腫瘤作用機(jī)制主要涉及激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+，致Ca2+大量釋放到胞漿激活細(xì)胞凋亡路徑[32-33]。2000年，姜泓等從蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中分離鑒定了一種蟲(chóng)草環(huán)肽A(cordycepeptide A，C27H41N3O5, 圖2)。之后，吳立軍研究組(2003)從蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)液中分離到環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)、環(huán)(亮氨酸-脯氨酸)、環(huán)(纈氨酸-脯氨酸)和環(huán)(丙氨酸-脯氨酸等數(shù)個(gè)環(huán)二肽。這幾種環(huán)肽的活性未見(jiàn)進(jìn)一步的報(bào)道。不過(guò)，該研究組從冬蟲(chóng)夏草培養(yǎng)液分離到一種環(huán)二肽，命名cordycedipeptide A(C10H17N3O3，圖2)，其對(duì)L-929、A375和Hela等腫瘤細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用[34]。Krasnoff研究組[35]從異足蛛蟲(chóng)草菌C. heteropoda中分離到兩個(gè)具有抗菌作用的線(xiàn)性七肽cicadapeptins I和II(見(jiàn)圖2)。Rukachaisirikul等[36]從未鑒定蟲(chóng)草Cordyceps sp. BCC 1788菌株中分離到一種環(huán)七肽，定名為cordyheptapeptide A(C49H65N7O8，圖2)，其對(duì)Vero細(xì)胞有細(xì)胞毒活性。Sakakura等從棒束孢蟲(chóng)草中分離獲得一個(gè)新的擬二肽，命名為hanasanagin(見(jiàn)圖2)，具有明顯的抗氧化作用[37]。最近，Asai等[38]從C. indigotica Kobayasi & Shimizu菌培養(yǎng)液中分離獲得了8種已知環(huán)狀縮酚肽類(lèi)化合物，即腐敗菌素(destruxins)A, A2, B, B2和E(見(jiàn)圖2)。

圖1 蟲(chóng)草菌的生物堿類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

圖2 蟲(chóng)草菌的多肽類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

1.3 甾醇類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 Kuo等在1990年代初，自冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中獲得兩個(gè)組分CS-36-39 和CS-48-51，其對(duì)多個(gè)腫瘤細(xì)胞株具有顯著細(xì)胞毒效應(yīng)，進(jìn)一步的化學(xué)分析提示，這個(gè)兩個(gè)組分非多糖和蟲(chóng)草素。之后，Bok等 (1999) 在冬蟲(chóng)夏草菌絲體中獲得兩個(gè)新的抗腫瘤甾醇次生代謝物，即5α,8α-表二氧-24(R)-甲基膽甾烷-6,22-二烯-3β-D-吡喃葡萄糖(C34H54O8，圖3中化合物1)和5α,6α-環(huán)氧-24(R)- 甲基膽甾烷-7,22-二烯-3β-醇(C28H44O2, 圖3化合物2)。同時(shí)得到兩個(gè)已知麥角甾醇衍生物 (見(jiàn)圖3化合物3與4)。而且，其抗腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，化合物1的葡萄糖配基是個(gè)增效基團(tuán)，可明顯提高其抗腫瘤作用。Kuo等[25]從蟬花中分離獲得兩個(gè)甾醇類(lèi)物質(zhì)，麥角甾醇及其過(guò)氧化物5α,8α-表二氧-24(R)-甲基膽甾烷-6,22-二烯-3β-醇(C28H44O3)(圖3中化合物5和6)，但未進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。不過(guò)，Nam等[39]對(duì)從高雄山蟲(chóng)草中獲得的5α,8α-表二氧-24(R)-甲基膽甾烷-6,22-二烯-3β-醇進(jìn)行了活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其可抑制人胃癌SNU-1、肝癌SNU-354、結(jié)腸直腸癌SNU-C4和鼠肉瘤S180等多種腫瘤細(xì)胞增殖。最近，我們研究組從江西蟲(chóng)草菌中獲得一種極有創(chuàng)制抗腫瘤新藥潛力的新化合物jiangxienone(見(jiàn)圖3中化合物7),其對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷能力是一線(xiàn)抗腫瘤藥物順鉑的至少6倍，且對(duì)正常細(xì)胞毒性小[40]，其作用機(jī)制經(jīng)由DNA損傷修復(fù)途徑[41]。

圖3 蟲(chóng)草菌的甾醇類(lèi)化合物

1.4 萜類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 蟲(chóng)草菌中含有豐富的萜類(lèi)化合物。真菌毒素有一類(lèi)重要的萜類(lèi)化合物叫單端孢霉烯(trichothecane)。Nam等[39]在高雄山蟲(chóng)草菌中分離獲得一個(gè)單端孢霉烯類(lèi)化合物，命名為4β-乙酰氧藨鐮刀菌烯-3α,15-二醇(acetoxyscirpenediol)(C17H24O6，圖4化合物1)，其抗腫瘤細(xì)胞毒效應(yīng)是臨床一線(xiàn)抗癌藥物順鉑的4～6倍。其抗腫瘤細(xì)胞毒效應(yīng)的作用機(jī)制結(jié)果提示，4β-乙酰氧藨鐮刀菌烯-3α,15-二醇主要經(jīng)由誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[42]。Chung研究組[43-45]從日本棒束孢中分離鑒定了一種單端孢霉烯衍生物，4-乙?；?12,13-環(huán)氧基-9-單端孢霉烯-3,15-二醇(見(jiàn)圖4中化合物2)。該化合物抗癌譜廣，對(duì)白血病、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞株均有抑制效應(yīng)。進(jìn)一步的研究提示，它的作用機(jī)制與Caspase依賴(lài)凋亡途徑有關(guān)，即通過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)活性氧生成，使胞內(nèi)谷胱甘肽抗氧化劑缺失，并激活Caspase-3凋亡酶，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，來(lái)源蟲(chóng)草的單端孢霉烯具有創(chuàng)制抗癌藥物的潛力。之后，Oshima研究組[46-48]先后從高雄山蟲(chóng)草菌中分離鑒定了6個(gè)新單端孢霉烯衍生物，其中paecilomycines A(C15H22O4)、B(C15H22O5)和C(C15H20O4)是帶有三環(huán)結(jié)構(gòu)的倍半萜(見(jiàn)圖4)，spirotenuipesines A (C15H22O4)和B(C15H22O5)是既帶有三環(huán)結(jié)構(gòu)又有螺環(huán)結(jié)構(gòu)的倍半萜(見(jiàn)圖4)，而tenuipesine A 是帶環(huán)丙烷環(huán)的新骨架單端孢霉烯?；钚栽u(píng)價(jià)結(jié)果提示，倍半萜paecilomycine A、spirotenuipesine A和B可促使人星形細(xì)胞瘤1321N1細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，誘導(dǎo)鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞分化。綜上，高雄山蟲(chóng)草稱(chēng)得上是生物合成新穎單端孢霉烯類(lèi)化合物的細(xì)胞工廠。本項(xiàng)目組先后從戴氏蟲(chóng)草菌和江西蟲(chóng)草菌中分離到四環(huán)三萜化合物helvolic acid，其對(duì)多個(gè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用，尤其是對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性[49-50]。

圖4 蟲(chóng)草菌的萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

1.5 聚酮類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 近些年來(lái)，在蟲(chóng)草菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)聚酮類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，具有結(jié)構(gòu)和生物活性多樣等特點(diǎn)。Seephonkai等[51]從一種未鑒定的蟲(chóng)草菌Cordyceps sp. BCC 1681中分離到類(lèi)似環(huán)庚三烯酚酮的次生代謝物，命名為cordytropolone(C9H8O4，圖5)。該化合物呈現(xiàn)中等的抗惡性瘧原蟲(chóng)Plasmodium falciparum K1與抗乳腺癌BC-1細(xì)胞毒活性(IC50=2.2μg/mL)。最近，Grudniewska等[52]從也一株未鑒定的蟲(chóng)草菌Cordyceps sp. NBRC 106954 獲得了一個(gè)特殊骨架的聚酮化合物Opaliferin(見(jiàn)圖5)，其通過(guò)一個(gè)外部雙鍵，把環(huán)戊酮和四氫呋喃鏈接在一起，但其功能活性尚待進(jìn)一步研究。

一個(gè)不可忽視的生物現(xiàn)象是，真菌中許多代謝途徑的次生代謝物質(zhì)合成基因在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下并不表達(dá)。日本學(xué)者Asai研究組近幾年的工作提示，表觀遺傳改良劑對(duì)蟲(chóng)草菌聚酮類(lèi)次生代謝產(chǎn)物合成有重要影響。Asai等[53]在C. indigotica Kobayasi & Shimizu菌發(fā)酵液中分離到1個(gè)新的芳香聚酮糖苷類(lèi)化合物indigotide A(C21H26O9，圖5)，以及1個(gè)已知的聚酮類(lèi)化合物NG-393(C22H28NO7，圖5)。有趣的是，在該菌培養(yǎng)液中加入表觀遺傳抑制劑5-氮雜胞苷(DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑)后，其代謝合成另一個(gè)新的芳香聚酮糖苷類(lèi)化合物indigotide B(C22H26O10，圖5)。而添加另一種表觀遺傳改良劑軟木肟酸(組蛋白脫乙?；敢种苿?到該菌培養(yǎng)液后，不僅分離獲得了indigotide A和B(見(jiàn)圖5)，還獲得6種新的芳香聚酮類(lèi)化合物indigotide C (C42H52O18，圖5)、D(C42H52O18，圖5)、E(C43H52O19，圖5)和F(C15H18O5，圖5)，以及13-hydroxyindigotide A(C21H26O10，圖5)，8-O-methylindigotide B(C23H28O10)[54]。因此表觀遺傳改良劑對(duì)蟲(chóng)草菌的生物代謝合成有重要影響，將可有效喚醒編碼次生代謝產(chǎn)物的沉默基因簇，從而使蟲(chóng)草菌合成一些新穎的具有潛在功效的次生活性代謝物。不過(guò)，這些新聚酮類(lèi)化合物的功效迄今未見(jiàn)報(bào)道。該研究組[55]利用表觀遺傳改良劑軟木肟酸處理另一個(gè)蟲(chóng)草菌C. annullata獲得5個(gè)新聚酮類(lèi)化合物annullatin A(C17H24O3，圖5), B(C17H26O3，圖5), C(C17H26O4，圖5), D(C17H22O4，圖5)和E(C12H8O3，圖5)，有趣的是它們具有類(lèi)似四氫大麻酚結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步的活性檢測(cè)提示，annullatin A對(duì)大麻素受體1(CB1)和2(CB2)均有明顯的拮抗活性，annullatin B是CB1的選擇性拮抗劑，annullatin D則對(duì)CB2有逆拮抗活性。另外，同時(shí)加入不同類(lèi)型的表觀遺傳改良劑對(duì)蟲(chóng)草菌的次生代謝產(chǎn)物合成有什么影響呢？為此他們?cè)谙x(chóng)草菌Isaria tenuipes 生長(zhǎng)過(guò)程同時(shí)加入組蛋白脫乙?；敢种苿┸浤倦克岷虳NA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑RG-108，結(jié)果顯示其極大地提高了次生代謝產(chǎn)物合成效率，并獲得一種新骨架聚酮類(lèi)化合物tenuipyrone(見(jiàn)圖5)[56]。

圖5 蟲(chóng)草菌的聚酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

1.6 其它次生代謝產(chǎn)物 蟲(chóng)草菌能代謝合成具有特定功能的天然萘醌、萘酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物。Kittakoop等(1999)自單側(cè)生蟲(chóng)草C. unilateralis獲得6個(gè)萘醌類(lèi)化合物，erythrostominone、deoxyerythrostominone、4-O-methyl erythro- stominone、epierythrostominol、deoxyerythrostominol和3,5,8-三羥基-6-甲氧基-2-(5-氧代-1,3-己二烯)-1,4-萘醌(見(jiàn)圖6)，均有抗瘧原蟲(chóng)活性，且前5個(gè)化合物乳腺癌BC、鼻咽癌KB等腫瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒效應(yīng)，特別是對(duì)BC細(xì)胞成效顯著。Isaka等[57]在擬蛹蟲(chóng)草C. pseudomilitaris 分離到11個(gè)聯(lián)萘酚類(lèi)(bioxanthracene)化合物(見(jiàn)圖6化合物1-11)，其中化合物1-10均具有較強(qiáng)的抗瘧原蟲(chóng)活性，其IC50值在1.1～8.4μg/mL范圍，化合物6、7和8對(duì)BC和KB癌細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒活性。此外，他們還在擬蛹蟲(chóng)草菌中分離到cordyanhydrides A(C20H22O8)和B(C29H32O11)，兩個(gè)含2～3個(gè)馬來(lái)酸酐的鏈烯酸(見(jiàn)圖6)[58]。天然產(chǎn)物中帶酸酐的化合物很罕見(jiàn)，雖然未見(jiàn)進(jìn)一步活性評(píng)價(jià)，但這些稀有的天然產(chǎn)物也許為創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供了更多的選擇。

圖6 蟲(chóng)草菌的萘醌、酚類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

圖7 蟲(chóng)草菌的有機(jī)酸、芳香醚等化合物結(jié)構(gòu)圖

蟲(chóng)草菌還能代謝合成有特殊結(jié)構(gòu)與活性的有機(jī)酸、芳香醚、大環(huán)內(nèi)酯等化合物。Watanabe等[59]在蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)液中分離獲得具有殺蟲(chóng)作用的吡啶二羧酸(見(jiàn)圖7)，可作為酚氧化酶原激活的抑制劑。更令人感到振奮的是，在辛萊克蟲(chóng)草C. sinclairii發(fā)酵液分離到(2S,3R,4R)-(E) -2-氨基-3,4-二羥基-2-(羥甲基)-14-氧代-6-二十烯酸(圖7)，亦稱(chēng)多球殼菌素(myriocin)或ISP-I。該化合物具有顯著的免疫抑制潛力，F(xiàn)ujita等 (1994) 觀察到其抑制T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞增殖的能力是臨床一線(xiàn)藥物環(huán)孢菌素的10～100倍，與另一種免疫抑制藥物FK-506相當(dāng)。但是，其作用機(jī)制有別于環(huán)孢菌素和FK-506。譬如，Miyake 等(1995)發(fā)現(xiàn)myriocin是通過(guò)降低CTLL-2細(xì)胞(IL-2依賴(lài)的鼠細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞系)中的絲氨酸軟脂酰轉(zhuǎn)移酶活性，抑制其分泌能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞生IL-2因子，而環(huán)孢菌素和FK-506卻能促使CTLL-2生成IL-2。值得提出的是，myriocin活性強(qiáng)，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，成藥性高，具有巨大的創(chuàng)制免疫抑制藥物潛力，而替代易引起腎功能衰竭的臨床一線(xiàn)藥物環(huán)孢菌素和FK-506。更有趣的是，F(xiàn)ujita等 (1996) 發(fā)現(xiàn)2-烷基-2-氨基丙烷-1,3-二醇是myriocin的有效部位，為該類(lèi)藥物篩選及化學(xué)合成提供了寶貴信息。最近，Krasnoff等[35]在異足蛛蟲(chóng)草發(fā)酵產(chǎn)物中也分離到myriocin，還發(fā)現(xiàn)其有抗菌作用。因此，蟲(chóng)草資源是新藥創(chuàng)制寶貴資源。

近來(lái)，Varughese等[60]從雙翅目蟲(chóng)草C. dipterigena Berk.& Br中獲得兩個(gè)新的縮酚酸環(huán)醚類(lèi)次生代謝物，cordycepsidone A (C18H12O8，圖7)和B (C18H12O9，圖7)，cordycepsidone A中芳香A環(huán)上的甲醛基發(fā)生氧化后生成B，也致使其選擇性抗植物病原真菌活性顯著減弱。Bunyapaiboonsri等[61]在一個(gè)未定名的蟲(chóng)草菌株Cordyceps sp. BCC 1861中發(fā)現(xiàn)6個(gè)二苯醚類(lèi)化合物，其中3個(gè)新化合物命名為cordyols A(C21H26O8，圖7)，B(C23H28O10，圖7)和C(C14H14O4，圖7)，另3個(gè)已知化合物分別是diorcinol，violaceol-I和violaceol-II。有趣的是cordyol C具有顯著的抗單純皰疹病毒活性(IC50=1.3μg/mL)，并對(duì)乳腺癌BC細(xì)胞核肺癌NCI-H187細(xì)胞具有中等細(xì)胞毒活性。violaceol-I和violaceol-II也呈現(xiàn)中等抗癌細(xì)胞毒活性，且有抗瘧原蟲(chóng)活性。除cordyol B外，其它幾個(gè)化合物還有一定的抗結(jié)核桿菌活性。另外，有些蟲(chóng)草菌也產(chǎn)大環(huán)內(nèi)酯天然產(chǎn)物。Rukachaisirikul研究組[62]在蛹蟲(chóng)草中發(fā)現(xiàn)4個(gè)抗瘧原蟲(chóng)活性的大環(huán)內(nèi)酯內(nèi)化合物，化合物1～3(圖7)是新化合物，化合物4為已知化合物cepharosporolide C。另外還分離得到cepharosporolide E、cepharosporolide F和2-羧甲基-4-(3’-丁羥基)呋喃等3個(gè)已知化合物。

2 蟲(chóng)草資源深度開(kāi)發(fā)利用的發(fā)展方向

近20多年來(lái)，人們一直致力于冬蟲(chóng)夏草替代品的研究，一方面是冬蟲(chóng)夏草菌的發(fā)酵生產(chǎn)；另一方面，蟲(chóng)草新資源的發(fā)掘。令人欣慰的是目前已證明巴西蟲(chóng)草C. brasilensis P. Henn.、九州蟲(chóng)草、高雄山蟲(chóng)草、日本蟲(chóng)草、粉被蟲(chóng)草、古尼蟲(chóng)草、香棒蟲(chóng)草C. barnesii Thwaites ex Berk. & Br.、甘肅蟲(chóng)草C. gansuensis Zhang ,Wang & Yan、蛾蛹草C. polyarthra Mêll.、涼山蟲(chóng)草、廣東蟲(chóng)草C. guangdongensis等均為可利用的替代資源。但同樣尚未解決人工規(guī)模培植關(guān)鍵技術(shù)，而天然野生資源的種群數(shù)量不可能滿(mǎn)足產(chǎn)業(yè)發(fā)展要求。因此，要實(shí)現(xiàn)可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用蟲(chóng)草資源，必需在與蟲(chóng)草相關(guān)的生物學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)等上游技術(shù)以及規(guī)?；l(fā)酵制備下游技術(shù)等方面取得突破，才是正確的選擇。主要包括以下幾方面：

2.1 蟲(chóng)草原料制備 蟲(chóng)草野生資源存在原料的數(shù)量不足、原料的質(zhì)量不穩(wěn)定以及破壞生態(tài)環(huán)境、甚至物種資源枯竭等諸多弊端。而絕大多數(shù)蟲(chóng)草的人工培植擴(kuò)繁技術(shù)迄今尚未攻克。因此，規(guī)?；l(fā)酵制備提供了便捷途徑。當(dāng)然，蟲(chóng)草的發(fā)酵也存在許多待解決的問(wèn)題，譬如，菌種分離難、保藏難、生長(zhǎng)慢、難培養(yǎng)等系列生物學(xué)問(wèn)題。不過(guò)，這些相比人工規(guī)模培植所涉及的分化問(wèn)題更易獲得突破。譬如冬蟲(chóng)夏草菌的低溫發(fā)酵技術(shù)已取得良好進(jìn)展，且已上市。

2.2 蟲(chóng)草制品亟待轉(zhuǎn)型升級(jí) 當(dāng)前，無(wú)論是蟲(chóng)草還是其培養(yǎng)物，蟲(chóng)草制品主要是一次性直接利用的生藥或粗制品，產(chǎn)品的技術(shù)含量和附加值低。因此，蟲(chóng)草產(chǎn)品在國(guó)際生物醫(yī)藥市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力弱，蟲(chóng)草原料的深加工刻不容。從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，更應(yīng)該注重蟲(chóng)草產(chǎn)品內(nèi)涵的提升，有更好更明確的功效，才會(huì)獲得消費(fèi)者持久的青睞。從本文評(píng)述的蟲(chóng)草多樣的次生活性代謝產(chǎn)物進(jìn)展看，蟲(chóng)草功效歸因于其豐富多樣的天然產(chǎn)物。同時(shí)我們也應(yīng)關(guān)注到，這些次生代謝產(chǎn)物在蟲(chóng)草菌中含量極低，深刻影響到其品質(zhì)。因此，可以采用合適的生物技術(shù)手段和發(fā)酵策略，把蟲(chóng)草發(fā)酵與特定活性物質(zhì)的生物代謝合成調(diào)控相結(jié)合，著眼于高技術(shù)高附加值二次性活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用。

2.3 蟲(chóng)草新資源次生代謝產(chǎn)物庫(kù)的建立及藥效學(xué)評(píng)價(jià) 我國(guó)蟲(chóng)草的研究工作多集中在冬蟲(chóng)夏草、蛹蟲(chóng)草和蟬花等少數(shù)幾種常見(jiàn)蟲(chóng)草，研究工作相對(duì)較深入。而對(duì)蟲(chóng)草新資源缺乏深入全面系統(tǒng)的研究。就物種本身而言，蟲(chóng)草菌在侵入寄主過(guò)程及定殖前為克服寄主天然的屏障，決定了其次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)域生物活性的多樣性，這些次生代謝產(chǎn)物是新藥創(chuàng)制的突破點(diǎn)。然而，一個(gè)不容忽視的問(wèn)題是，在常態(tài)下，許多蟲(chóng)草的特殊代謝途徑并不啟用，或者說(shuō)調(diào)節(jié)特殊功能次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶和基因處于沉默狀態(tài)，故常規(guī)的培養(yǎng)方式影響對(duì)其次生代謝產(chǎn)物庫(kù)的發(fā)掘。因此，我們?cè)谘芯科浯x產(chǎn)物庫(kù)時(shí)，既要考慮不同蟲(chóng)草物種間的差別，更要考慮同一物種不同環(huán)境條件下存在代謝途徑的巨大差異。而在外界干預(yù)的特殊環(huán)境下，可能是發(fā)掘蟲(chóng)草資源開(kāi)發(fā)利用潛力的有效途徑。在系統(tǒng)研究蟲(chóng)草新資源次生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，建立天然產(chǎn)物化合物庫(kù)，并積極開(kāi)展活性評(píng)價(jià)、作用機(jī)制及成藥性研究，為蟲(chóng)草資源的深度開(kāi)發(fā)利奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Buenz E J,Bauer B A,Osmundson T W,et al.The traditional Chinese medicine Cordyceps sinensis and its effects on apoptotic homeostasis [J].J Ethnopharmacol,2005,96(1):19-29.

[2] Sung G H,Hywel-Jones N L,Sung J M,et al.Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi [J].Stud Mycol,2007,57(1):5-59.

[3] Xiao J H and Zhong J J.Secondary metabolites from Cordyceps species and their antitumor activity studies [J].Recent Patents Biotechnol,2007,1(2):123-137.

[4] 梁宗琦,劉愛(ài)英,劉作易.中國(guó)真菌志蟲(chóng)草屬 [M]. 第23卷.北京:科學(xué)出版社,2007.

[5] Paterson R R M.Cordyceps - a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory?[J].Phytochemistry,2008,69(7):1469-1495.

[6] Zhong J J and Xiao J H.Secondary metabolites from higher fungi:Discovery,bioactivity,and bioproduction [J].Adv Biochem Engin Biotechnol,2009,113:79-151.

[7] Holliday J C,Cleaver M.Medicinal value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr.) link (Ascomycetes).A review [J].Int J Med Mushrooms,2008,10(3):219-234.

[8] Nikoh N,Fukatsu T.Interkingdom host jumping underground:phylogenetic analysis of entomoparasistic fungi of the genus Cordyceps [J].Mol Biol Evol,2000,17(4):629-638.

[9] Isaka M,Kittakoop P,Kirtikara K,et al.Bioactive substances from insect pathogenic fungi [J].Acc Chem Res,2005,38(10):813-823.

[10] Ahn Y J,Park S J,Lee S G,et al.Cordycepin:selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp [J].J Agr Food Chem,2000,48(7)：2744-2748.

[11] Xu F L,Lee Y L,Tsa W Y,et al.Effect of cordycepin on Hantaan virus 76-118 infection of primary human embryonic pulmonary fibroblasts-characterization of apoptotic effects [J].Acta Virol,2005,49(3):183-193.

[12] Kim J R,Yeon S H,Kim H S,et al.Larvicidal activity against Plutella xylostella of cordycepin from the fruiting body of Cordyceps militaris [J].Pest Manag Sci,2002,58(7):713-717.

[13] Madla S,Methacanon P,Prasitsil M,et al.Characterization of biocompatible fungi-derived polymers that induce IL-8 production [J].Carbohydr Polym,2005,59(3):275-280.

[14] Rottenberg M E,Masocha W,Ferella M,et al.Treatment of African trypanosomiasis with cordycepin and adenosine deaminase inhibitors in a mouse model [J].J Infect Dis,2005,192(9):1658-1665.

[15] Isaka M，Tanticharoen M.Structures of Cordypyridones A-D,antimalarial N-hydroxy- and N-methoxy-2-pyridones from the insect pathogenic fungus Cordyceps nipponica [J].J Org Chem,2001,66(14):4803-4808.

[16] Schmidt K,Günther W,Stoyanova S,et al.Militarinone A,a neurotrophic pyridone alkaloid from Paecilomyces militaris [J].Org Lett,2002,4(2):197-199.

[17] Schmidt K,Riese U,Li Z Z,et al.Novel tetramic acids and pyridone alkaloids,militarinones B,C,and D,from the insect pathogenic fungus Paecilomyces militaris [J].J Nat Prod,2003,66(3):378-383.

[18] Cheng Y,Schneider B,Riese U,et al.(+)-N-deoxymilitarinone A,a neuritogenic pyridone alkaloid from the insect pathogenic fungus Paecilomyces farinosus [J].J Nat Prod,2006,69(3):436-438.

[19] Cheng Y,Schneider B,Riese U,et al.Farinosones A-C,neurotrophic alkaloidal metabolites from the entomogenous deuteromycete Paecilomyces farinosus [J].J Nat Prod,2004,67(11):1854-1858.

[20] Lang G,Blunt J W,Cummings N J,et al.Paecilosetin,a new bioactive fungal metabolite from a New Zealand isolate of Paecilomyces farinosus [J].J Nat Prod,2005,68(5):810-811.

[21] Ma C,Li Y,Niu S B,et al.N-Hydroxypyridones,phenylhydrazones,and a quinazolinone from Isaria farinosa [J].J Nat Prod,2011,74(1):32-37.

[22] Haritakun R,Srikitikulchai P,Khoyaiklang P,et al.Isariotins A-D,alkaloids from the insect pathogenic fungus Isaria tenuipes BCC 7831 [J].J Nat Prod,2007,70(9):1478-1480.

[23] Bunyapaiboonsri T,Yoiprommarat S,Intereya K,et al.Isariotins E and F,spirocyclic and bicyclic hemiacetals from the entomopathogenic fungus Isaria tenuipes BCC 12625 [J].J Nat Prod,2009,72(4):756-759.

[24] Oh H,Kim T,Oh G S,et al.(3R,6R)-4-methyl-6-(1-methylethyl)-3-phenylmethyl perhydro-1,4-oxazine-2,5-dione:an apoptosis-inducer from the fruiting bodies of Isaria japonica [J].Planta Med,2002,68(4):345-348.

[25] Kuo Y C,Lin L C,Don M J,et al.Cyclodesipeptide and dioxomorpholine derivatives isolated from the insect-body portion of the fungus Cordyceps cicadae [J].J Chin Med,2002,13(4):209-219.

[26] Isaka M,Boonkhao B,Rachtawee P,et al.A xanthocillin-like alkaloid from the insect pathogenic fungus Cordyceps brunnearubra BCC 1395 [J].J Nat Prod,2007,70 (4):656-658.

[27] Yang M L,Kuo P C,Hwang T L,et al.Anti-inflammatory principles from Cordyceps sinensis [J].J Nat Prod,2011,74(9):1996-2000.

[28] Jow G M,Chou C J,Chen B F,et al.Beauvericin induces cytotoxic effects in human acute lymphoblastic leukemia cells through cytochrome c release,caspase 3 activation:the causative role of calcium[J].Cancer Lett,2004,216(2):165-173.

[29] Nilanonta C,Isaka M,Kittakoop P,et al.Precursor-directed biosynthesis of beauvericin analogs by the insect pathogenic fungus Paecilomyces tenuipes BBC 1614 [J].Tetrahedron,2002,58(17):3355-3360.

[30] Kouri K,Duchen M R,Lemmens-Gruber R.Effects of beauvericin on the metabolic state and ionic homeostasis of ventricular myocytes of the guinea pig [J].Chem Res Toxicol,2005,18(11):1661-1668.

[31] Calo L,Fornelli F,Ramires R,et al.Cytotoxic effects of the mycotoxin beauvericin to human cell lines of myeloid origin [J].Pharmacol Res,2004,49(1):73-77.

[32] Ojcius D M,Zychilinsky A,Zheng L M,et al.Ionophore-induced apoptosis:role of DNA fragmentation and calcium flux [J].Exp Cell Res,1991,197(1):43-49.

[33] Kim M K,Seong S Y,Seoh J Y,et al.Orientia tsutsugamushi inhibits apoptosis of macrophages by retarding intracellular calcium release [J].Infect Immun,2002,70(8):4692-4696.

[34] Jia J M,Ma X C,Wu C F,et al.Cordycedipeptide A,a new cyclodipeptide from the culture liquid of Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc [J].Chem Pharm Bull,2005,53(5):582-583.

[35] Krasnoff S B,Reátegui R F,Wagenaar M M,et al.Cicadapeptins I and II:new aib-containing peptides from the entomopathogenic fungus Cordyceps heteropoda [J].J Nat Prod,2005,68(1):50-55.

[36] Rukachaisirikul V,Chantaruk S,Tansakul C,et al.A cyclopeptide from the insect pathogenic fungus Cordyceps sp.BCC 1788 [J].J Nat Prod,2006,69(2):305-307.

[37] Sakakura A,Shioya K,Katsuzaki H,et al.Isolation,structural elucidation and synthesis of a novel antioxidative pseudo-di-peptide,Hanasanagin,and its biogenetic precursor from the Isaria japonica mushroom [J].Tetrahedron,2009,65 (34):6822-6827.

[38] Asai T,Yamamoto T,Chung Y M,et al.Aromatic Polyketide Glycosides from an Entomopathogenic Fungus,Cordyceps indigotica [J].Tetrahedron Lett,2012,53(3):277-280.

[39] Nam K S,Jo Y S,Kim Y H,et al.Cytotoxic activities of acetoxyscirpenediol and ergosterol peroxide from Paecilomyces tenuipes [J].Life Sci,2001,69(2):229-237.

[40] Xiao J H,Sun Z H,Pan W D,et al.Jiangxienone,a new compound with potent cytotoxicity against tumor cells from traditional Chinese medicinal mushroom Cordyceps jiangxiensis [J].Chem Biodiver,2012,9(7):1349-1355.

[41] Lü Y H,Pan W D,Xiao J H,et al.Cytotoxic mechanism of novel compound jiangxienone from Cordyceps jiangxiensis against cancer cells involving DNA damage response pathway [J].Process Biochem,2014,49(4):697-705.

[42] Han H C,Lindequist U,Hyun J W,et al.Apoptosis induction by 4β-acetoxyscirpendiol from Paecilomyces tenuipes in human leukaemia cell lines [J].Pharmazie,2004,59(1):42-49.

[43] Oh G S,Hong K H,Oh H,et al.4-acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol isolated from the fruiting bodies of Isaria japonica YASUDA induces apoptosis of human leukemia cells (HL-60) [J].Biol Pharm Bull,2001,24(7):785-789.

[44] Pae H O,Oh G S,Choi B M,et al.Induction of apoptosis by 4-acetyl-12,13-epoxyl-9- trichothecene-3,15-diol from Isaria japonica Yasuda through intracellular reactive oxygen species formation and Caspase-3 activation in human leukemia HL-60 cells [J].Toxicol Vitro,2003,17(1):49-57.

[45] Kim H J,Jang I J,Kim Y J,et al.4-acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol from Isaria japonica mediates apoptosis of rat bladder carcinoma NBT-II cells by decreasing anti-apoptotic Bcl-2 expression and increasing pro-apoptotic bax expression [J].Am J Chin Med,2004,32(3):377-387.

[46] Kikuchi H,Miyagawa Y,Sahashi Y,et al.Novel trichothecanes,paecilomycine A,B,and C,isolated fromentomopathogenic fungus,Paecilomyces tenuipes [J].Tetrahedron Lett,2004,45(33):6225-6228.

[47] Kikuchi H,Miyagawa Y,Sahashi Y,et al.Novel spirocyclic trichothecanes,spirotenuipesine A and B,isolated from entomopathogenic fungus,Paecilomyces tenuipes [J].J Org Chem,2004,69(2):352-356.

[48] Kikuchi H,Miyagawa Y,Nakamura K,et al.A novel carbon skeletal trichothecane,tenuipesine A,isolated from an entomopathogenic fungus,Paecilomyces tenuipes [J].Org Lett,2004,6(24):4531-4533.

[49] Dou Y,Xiao J H,Xia X X,et al.Effect of oxygen supply on biomass and helvolic acid production in submerged fermentation of Cordyceps taii [J].Biochem Eng J,2013,81(1):73-79.

[50] 陳超,潘衛(wèi)東,肖建輝,等.江西青霉甲醇提取物中的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(22):97-101.

[51] Seephonkai P,Isaka M,Kittakoop P,et al.A new tropolone from the insect pathogenic fungus Cordyceps sp.BCC 1681 [J].J Antibiot,2001,54(9):751-752.

[52] Grudniewska A,Hayashi S,Shimizu M,et al.Opaliferin,new polyketide from cultures of entomopathogenic fungus Cordyceps sp.NBRC 106954 [J].Org Lett,2014,16(18):4695-4697.

[53] Asai T,Yamamoto T,Chung Y M,et al.Aromatic Polyketide Glycosides from an Entomopathogenic Fungus,Cordyceps indigotica [J].Tetrahedron Lett,2012,53(3):277-280.

[54] Asai T,Yamamoto T,Oshima Y.Aromatic polyketide production in Cordyceps indigotica,an entomopathogenic fungus,induced by exposure to a histone deacetylase inhibitor [J].Org Lett,2012,14(8):2006-2009.

[55] Asai T,Luo D,Obara Y,et al.Dihydrobenzofurans as cannabinoid receptor ligands from Cordyceps annullata,an entomopathogenic fungus cultivated in the presence of an HDAC inhibitor [J]. Tetrahedron Lett, 2012,53(18):2239-2243.

[56] Asai T,Chung Y M,Sakurai H,et al.Tenuipyrone,a novel skeletal polyketide from the entomopathogenic fungus,Isaria tenuipes,cultivated in the presence of epigenetic modifiers [J].Org Lett,2012,14(2):513-515.

[57] Jaturapat A,Isaka M,Hywel-Jones N L,et al.Bioxanthracenes from the insect pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620-I.taxonomy,fermentation,isolation and antimalarial activity [J].J Antibiot,2001,54(1)：29-35.

[58] Isaka M,Tanticharoen M,Thebtaranonth Y.Cordyanhydrides A and B.two unique anhydrides from the insect pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620 [J].Tetrahedron Lett,2000,41(10):1657-1660.

[59] Watanabe N,Hattori M,Yokoyama E,et al.Entomogenous fungi that produce 2,6-pyridine dicarboxylic acid (dipicolinic acid) [J].J Biosci Bioeng, 2006,102(4):365-368.

[60] Varughese T,Riosa N,Higginbotham S,et al.Antifungal depsidone metabolites from Cordyceps dipterigena,an endophytic fungus antagonistic to the phytopathogen Gibberella fujikuroi [J].Tetrahedron Lett，2012,53(13):1624-1626.

[61] Bunyapaiboonsri T,Yoiprommarat S,Intereya K,et al.New diphenyl ethers from the insect pathogenic fungus Cordyceps sp.BCC 1861 [J].Chem Pharm Bull,2007,55(2):304-307.

[62] Rukachaisirikul V,Pramjit S,Pakawatchai C,et al.10-membered macrolides from the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris BCC 2816 [J].J Nat Prod,2004,67(11):1953-1955.