安全劑cyprosulfamide對(duì)煙嘧磺隆的解毒作用

劉小民， 張宏軍， 李秉華， 鈕麗娜， 王貴啟

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊 050035；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

煙嘧磺隆(nicosulfuron)，中文名稱為2-(4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰氨基磺酰)N，N-二甲基煙酰胺，是日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社開(kāi)發(fā)的玉米田磺酰脲類除草劑[1]。煙嘧磺隆殺草譜廣，具有較好的莖葉處理活性，除草效果突出，尤其對(duì)玉米田惡性禾本科雜草有較好的防除效果，因而在生產(chǎn)上被大面積推廣應(yīng)用。隨著煙嘧磺隆使用面積的大幅度上升，其藥害問(wèn)題也日益突出，近年來(lái)不斷有關(guān)于煙嘧磺隆對(duì)玉米造成藥害的報(bào)道。陶波等研究表明：玉米不同類型品種間對(duì)煙嘧磺隆耐性差異明顯，其中爆裂型玉米對(duì)煙嘧磺隆最為敏感[2]。董曉雯等研究表明：32種供試玉米品種中的7個(gè)品種對(duì)煙嘧磺隆較敏感，60 g a.i./hm2處理下，施藥13 d后對(duì)敏感型玉米品種的鮮重抑制率高達(dá)65.59%[3]。煙嘧磺隆對(duì)玉米產(chǎn)生藥害的癥狀主要表現(xiàn)為：玉米葉片出現(xiàn)不規(guī)則褪綠斑，嚴(yán)重時(shí)葉片卷縮成筒狀，葉緣皺縮，心葉呈牛尾狀，不能正常抽出，植株矮化，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生叢生、次生莖[4-5]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藥劑：95.5%煙嘧磺隆原藥(滄州科潤(rùn)化工有限公司)；cyprosulfamide(Sigma公司)；1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)、聚乙烯聚吡咯唍酮(PVPP)及還原型谷胱甘肽(GSH)、牛血清白蛋白(BSA)，均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

供試玉米12HB02由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所玉米研究中心提供，試驗(yàn)土壤取自河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所堤上試驗(yàn)站1～15 cm無(wú)污染的耕層土壤，過(guò)篩、自然風(fēng)干后使用。土壤pH值為7.10，有機(jī)質(zhì)含量為2.07%。

1.2 cyprosulfamide對(duì)煙嘧磺隆的解毒效果試驗(yàn)

將精選的玉米種子均勻播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土的盆缽中(高10 cm、直徑11 cm)，采用底部滲灌方式，使盆缽中的土壤完全濕潤(rùn)，然后覆土1.0 cm后置于溫室苗床上。待玉米培養(yǎng)至3葉1心期，每盆定苗至3株。煙嘧磺隆處理濃度分別為30、60、90 g a.i./hm2，cyprosulfamide添加比例分別為 1 ∶0.2、1 ∶1、1 ∶5。噴藥器械為ASS-1型農(nóng)藥噴灑系統(tǒng)，XR8003扇形噴頭，噴霧壓力為0.3 MPa，噴藥量為 400 L/hm2。施藥14 d后測(cè)量各處理玉米株高及地上部分鮮重。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用DPS7.0軟件進(jìn)行處理和方差分析。

1.3 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)酶液制備及活性測(cè)定

施藥3 d后，取玉米葉片1.0 g，液氮速凍后，研磨成粉末，然后向其中加入3 mL GST酶提取液(含1 mmol/L EDTA、14 mmol/L 巰基乙醇、75 g/kg聚乙烯吡咯烷酮的0.1 mol/L pH 值7.5 Tris-HCl緩沖液)。4 ℃下15 000g離心20 min，所得上清液即為待測(cè)酶液。

參照Habig等試驗(yàn)方法[8]，稍做修改，向含有 30 μL 100 mmol/L CDNB、30 μL 100 mmol/L GSH的0.1 mol/L pH值6.5的PBS溶液900 μL中加入100 μL酶液，共計(jì)1 mL體系，對(duì)照加入100 μL PBS溶液，25 ℃水浴中保溫10 min后，置于比色皿中，記錄340 nm處吸光度在5 min內(nèi)的變化，每隔1min讀數(shù)1次。

GSTs活力單位(μmol/min)=(ΔD340 nm·V)/(ε·L)

式中：ΔD340 nm為每1 min 340 nm處吸光度的變化值，V為酶促反應(yīng)體積(3 mL)，ε為產(chǎn)物的消光系數(shù)[0.009 6 L/(μmol·cm)]，L為比色杯光程(1 cm)。

GST比活力[μmol/(min·mg)]= 酶活力單位/測(cè)定所用酶蛋白量。

蛋白定量測(cè)定參照Bradford的考馬斯亮藍(lán) G-250 法[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 cyprosulfamide減輕煙嘧磺隆對(duì)玉米生長(zhǎng)影響的作用

由表1可以看出，隨著煙嘧磺隆處理濃度的增大，對(duì)玉米株高及鮮重的抑制率逐漸增大。煙嘧磺隆30、60、90 g a.i./hm2處理下，對(duì)玉米株高的抑制率分別為18.10%、21.28%、37.75%，對(duì)玉米鮮重的抑制率分別為34.97%、42.97%、62.73%。添加不同比例cyprosulfamide之后，減輕了煙嘧磺隆對(duì)玉米株高、鮮重的抑制。煙嘧磺隆處理濃度相同，添加不同比例cyprosulfamide各處理之間對(duì)煙嘧磺隆的解毒效果存在差異。當(dāng)煙嘧磺隆處理濃度為 30 g a.i./hm2時(shí)，cyprosulfamide添加比例為1 ∶0.2對(duì)其解毒效果最好，對(duì)玉米株高、鮮重的抑制率分別為13.68%、23.92%，分別比30 g a.i./hm2煙嘧磺隆處理降低4.42、11.05百分點(diǎn)。當(dāng)煙嘧磺隆處理濃度為60 g a.i./hm2時(shí)，cyprosulfamide添加比例為1 ∶1對(duì)其解毒效果最好，對(duì)玉米株高、鮮重的抑制率分別為17.44%、31.65%，分別比60 g a.i./hm2煙嘧磺隆處理降低3.84、11.32百分點(diǎn)。當(dāng)煙嘧磺隆處理濃度為90 g a.i./hm2時(shí)，cyprosulfamide添加比例為1 ∶5對(duì)其解毒效果最好，對(duì)玉米株高及鮮重的抑制率分別為18.43%、33.55%，分別比90 g a.i./hm2煙嘧磺隆處理降低19.32、29.18百分點(diǎn)。

表1 煙嘧磺隆處理中添加不同比例cyprosulfamide對(duì)玉米株高及鮮重生長(zhǎng)的影響

2.2 cyprosulfamide對(duì)玉米體內(nèi)GST活性的影響

圖2為煙嘧磺隆添加不同比例安全劑cyprosulfamide對(duì)玉米體內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性的影響。結(jié)果表明，煙嘧磺隆不同處理誘導(dǎo)玉米體內(nèi)GST活性的增加。當(dāng)煙嘧磺隆的處理濃度為30、60、90 g a.i./hm2時(shí)，玉米體內(nèi)GST比活力活性分別為0.911、1.220、0.969 μmol/(min·mg)，分別比對(duì)照的0.827 μmol/(min·mg)增加10.3%、47.8%、17.3%。添加不同比例cyprosulfamide后，玉米體內(nèi)GST比活力均有所增加。煙嘧磺隆處理濃度為 30 g a.i./hm2時(shí)，cyprosulfamide添加比例為 1 ∶0.2、1 ∶1、1 ∶5，玉米體內(nèi)GST比活力分別為1.224、1.131、1.102 μmol/(min·mg)，分別比煙嘧磺隆單獨(dú)使用增加34.4%、24.2%、21.0%。煙嘧磺隆處理濃度為60 g a.i./hm2時(shí)，不同比例cyprosulfamide處理玉米體內(nèi)GST比活力分別為1.547、1.582、1.388 μmol/(min·mg)，分別增加了26.8%、29.7%、13.7%。煙嘧磺隆處理濃度為 90 g a.i./hm2時(shí)，不同比例cyprosulfamide處理玉米體內(nèi)GST比活力分別為1.142、1.313、1.277 μmol/(min·mg)，分別增加了17.9%、35.6%、31.8%。GST比活力的增加，進(jìn)一步催化谷胱甘肽與煙嘧磺隆發(fā)生軛合，從而減輕了煙嘧磺隆對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響。

3 結(jié)論與討論

安全劑的作用機(jī)制在過(guò)去幾十年來(lái)一直受到人們的廣泛關(guān)注，但明確的作用機(jī)制仍未闡明。相似結(jié)構(gòu)活性理論(QSAR)、谷胱甘肽軛合論以及細(xì)胞色素P450單氧化酶催化的羥基化理論是最為普遍的機(jī)制解釋[10-12]。其中谷胱甘肽軛合論指出安全劑主要通過(guò)增進(jìn)還原型谷胱甘肽含量及提高谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性來(lái)軛合除草劑的有毒代謝物，從而減輕或消除其毒害。Tan等研究了 MG-191 對(duì)玉米內(nèi)乙草胺代謝的影響，發(fā)現(xiàn)玉米經(jīng)安全劑 MG-191 處理后體內(nèi)的GSH含量提高了30%，GST酶的活性提高了34%[13]。葉非等研究證實(shí)安全劑AD-27能夠提高單嘧磺隆處理后的高粱幼苗中的GSH含量， 促進(jìn)單嘧磺隆與GSH的軛合作用，從而緩解單嘧磺隆對(duì)高粱產(chǎn)生的藥害[14]。本研究結(jié)果表明，添加不同比例安全劑cyprosulfamide后，玉米體內(nèi)GST比活力均有所增加。當(dāng)煙嘧磺隆處理濃度不同時(shí)，要減輕煙嘧磺隆對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響，所需要添加的安全劑cyprosulfamide比例不同。低濃度的煙嘧磺隆處理需要添加cyprosulfamide的比例較小，而當(dāng)煙嘧磺隆濃度增大后，需要添加安全劑的比例也需要相應(yīng)增大。葉非等研究指出，只有當(dāng)安全劑AD-67與單嘧磺隆濃度為一定配比時(shí)，才能較好地起到保護(hù)作物免受除草劑藥害的作用[14-15]，與本研究結(jié)果類似。

安全劑是除草劑研究的一個(gè)分支，具有廣闊的發(fā)展前景及開(kāi)發(fā)應(yīng)用市場(chǎng)。由于安全劑的作用機(jī)理還不十分清楚，因此今后需要利用生物化學(xué)、植物生理學(xué)及分子生物學(xué)等知識(shí)進(jìn)一步從分子水平上研究安全劑的作用機(jī)理，并對(duì)除草劑、安全劑、作物三者之間的相互作用機(jī)制進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]蘇少泉. 煙嘧磺隆劑型與使用中的若干問(wèn)題[J]. 農(nóng)藥研究與應(yīng)用，2007，11(1)：9-12.

[2]陶 波，蘇少泉，劉金宇. 農(nóng)作物對(duì)磺酰脲類除草劑耐性的研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26(2)：105-110.

[3]董曉雯，王金信，畢建杰，等. 不同玉米品種對(duì)煙嘧磺隆的敏感性差異[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2007，34(2)：182-186.

[4]張玉聚，張德勝，張俊濤，等. 磺酰脲類除草劑的藥害與安全應(yīng)用[J]. 農(nóng)藥，2003，42(6)：42-44.

[5]王險(xiǎn)峰，范志偉，胡榮娟，等. 除草劑藥害新進(jìn)展與解決方法[J]. 農(nóng)藥，2009，48(5)：384-388.

[6]Thiencarbazone-methyl S H，Cyprosulfamide. -a new herbicide and a new safener for use in corn[J]. Julius-Kühn-Archiv，2012(434)：499-505.

[7]Robinson D E，Soltani N，Shropshire C，et al. Cyprosulfamide safens isoxaflutole in sweet corn(ZeamaysL.)[J]. HortScience，2013，48(10)：1262-1265.

[8]Habig W H，Pabst M J，Jakoby W B. GlutathioneS-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation[J]. Journal of Biological Chemistry，1974，249(22)：7130-7139.

[9]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72(1)：248-254.

[10]邊 強(qiáng)，寇俊杰，鞠國(guó)棟，等. 磺酰脲類除草劑安全劑的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥，2011，50(10)：703-707，710.

[11]畢洪梅，張金艷，葉 非，等. 除草劑安全劑的作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理，2007，28(1)：32-34，40.

[12]劉祥英，柏連陽(yáng).磺酰脲類除草劑及其安全劑研究進(jìn)展[J]. 雜草科學(xué)，2005(1)：1-4.

[13]Tan S Y，Evans R R，Dahmer M L，et al. Imidazolinone-tolerant crops：history，current status and future[J]. Pest Management Science，2005，61(3)：246-257.

[14]葉 非，付 穎，徐偉鈞，等. 安全劑AD-67減輕單嘧磺隆對(duì)高粱藥害的作用[J]. 植物保護(hù)，2010，36(2)：105-108.

[15]葉 非，付 穎，徐偉鈞，等. 安全劑AD-67保護(hù)玉米免受單嘧磺隆藥害的作用及其機(jī)理[J]. 植物保護(hù)，2010，36(4)：90-93.