RP-HPLC法測(cè)定毛果魚(yú)藤中美迪紫檀素的含量

吳紅果，黃 威，婁華勇，梁光義，潘衛(wèi)東

(1. 貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550002; 2. 遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099; 3. 貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

毛果魚(yú)藤 (DerriseriocarpaHow)為豆科(Leguminosae)魚(yú)藤屬(Derris)植物。主要分布在云南、廣西一帶，別名為土甘草、雞血藤、藤甘草等[1]。其根入藥能夠補(bǔ)血、潤(rùn)腸，常用于治療咳嗽、發(fā)燒胸悶、咽喉痛；藤莖具有鎮(zhèn)咳化痰、利尿除濕的功效，民間常用來(lái)治療膀胱炎、腎炎、尿道炎、咳嗽等癥[2-4]。目前毛果魚(yú)藤中已報(bào)道的化學(xué)成分有三萜、甾體、脂肪酸類(lèi)化合物[5-6]，其他類(lèi)型的化學(xué)成分尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組對(duì)毛果魚(yú)藤藥材的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離鑒定了三萜、甾體和一系列黃酮類(lèi)成分，其中黃酮類(lèi)化合物美迪紫檀素為其主要的化學(xué)成分，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，美迪紫檀素具有抗結(jié)核、抗真菌及抗腫瘤等作用[7-9]。到目前為止，毛果魚(yú)藤中黃酮類(lèi)化合物的含量測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道。為了更有效的控制毛果魚(yú)藤的質(zhì)量，本文首次以美迪紫檀素作為指標(biāo)性成分，采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，建立了毛果魚(yú)藤藥材中美迪紫檀素的RP-HPLC含量測(cè)定方法，以期對(duì)毛果魚(yú)藤的研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-1100高效液相色譜系統(tǒng)(G1311A泵、G1315A DVD檢測(cè)器、Agilent色譜工作站)，SG5200H超聲波清洗儀(河南兄弟儀器設(shè)備有限公司)，梅特勒-托利多AL204電子天平(上海速展計(jì)量?jī)x器有限公司)；色譜純乙腈和甲醇為天津登科化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，水為重蒸水并經(jīng)0.45 μm水系濾膜過(guò)濾，其他試劑均為分析純。

1.2 試藥 美迪紫檀素對(duì)照品為自制，經(jīng)ESI-MS、UV、IR、1H-NMR和13C-NMR鑒定為美迪紫檀素，經(jīng)DVD檢測(cè)器檢測(cè)，峰面積歸一化法計(jì)算其純度>98%；毛果魚(yú)藤藥材采自貴州省興義市，經(jīng)貴陽(yáng)市中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定為豆科魚(yú)藤屬植物毛果魚(yú)藤DerriseriocarpaHow，樣本保存在貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取美迪紫檀素對(duì)照品2.86 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取樣品粉末(過(guò)40目篩)約5.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇150 mL，密塞，稱定質(zhì)量，室溫下冷浸30 min，超聲處理120 min，取出，冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足至原質(zhì)量，搖勻，0.45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 采用Hypersil-BDS C18色譜柱 (5 μm,250 mm×4.6 mm)，柱溫為30.0 ℃，流動(dòng)相為乙腈 (A)-0.1 %醋酸水溶液(B)梯度洗脫(0～30 min,20% A→40% A, 80% B→60% B)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm，進(jìn)樣體積為20 μL。在以上色譜條件下，美迪紫檀素對(duì)照品和毛果魚(yú)藤樣品色譜圖(見(jiàn)圖1)。

圖1 毛果魚(yú)藤樣品(A)與美迪紫檀素對(duì)照品(B)的HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.1.1”項(xiàng)下美迪紫檀素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量。分別以1、2、4、8、10、16、20 μL的進(jìn)樣體積注入液相色譜儀，按“2.2”色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量 (ng) 為橫坐標(biāo) (X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo) (Y)，經(jīng)線性回歸處理得美迪紫檀素的回歸方程：Y=2.064X+5.7612，R2= 0.9992。結(jié)果表明，美迪紫檀素在0.0572～1.1440 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取美迪紫檀素對(duì)照品儲(chǔ)備液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.2”色譜條件測(cè)定，記錄美迪紫檀素的峰面積，RSD (n = 6) 為1.70 %。說(shuō)明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.1.2”的方法配制供試液1份，在“2.2”色譜條件下，每隔4 h進(jìn)樣1次，每次20 μL共6次，記錄美迪紫檀素的峰面積，RSD為1.55 %，數(shù)據(jù)表明供試液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取毛果魚(yú)藤藥材1批，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，制得6份供試液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄美迪紫檀素的峰面積，并計(jì)算含量。平均含量為0.002 8%，RSD為1.27%。說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品2.5 g共6份，另精密稱取美迪紫檀素對(duì)照品0.085 mg。依照“2.1.2”的方法制備供試液，平行制備6份，按“2.2”色譜條件測(cè)定，記錄美迪紫檀素的峰面積，計(jì)算樣品含量和回收率。結(jié)果表明美迪紫檀素平均回收率為100.78 %，RSD為1.81 %(見(jiàn)表1)。

表1美迪紫檀素加樣回收率試驗(yàn)

序列取樣量/g樣品中含量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%12.50400.07010.0850.153798.3522.50350.07010.0850.154599.2932.50570.07020.0850.1582103.5342.50320.07010.0850.1564101.5352.50270.07010.0850.1563101.4162.50460.07010.0850.1556100.59100.781.81

2.8 樣品含量測(cè)定 依照“2.1.2”的方法制備3個(gè)批次的供試液，每個(gè)批次平行制備3份供試液。按“2.2”色譜條件測(cè)定樣品含量，記錄美迪紫檀素的峰面積，含量測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表2)。

表2美迪紫檀素含量的測(cè)定

批次取樣量/g峰面積含量/10-3 %平均含量/10-3 %RSD/%5.0050228.9702.7015.0011221.7682.622.671.565.0080227.1422.685.0016224.5972.6525.0048231.5992.732.701.715.0056231.4392.735.0028229.8092.7135.0037223.3552.632.651.865.0014222.2222.62

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 取供試品粉末約2 g，分別用甲醇、乙醇、乙酸乙酯為溶劑超聲30 min，乙酸乙酯液蒸干后用甲醇溶解，并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明以甲醇為提取溶劑時(shí)雜質(zhì)峰較少。

3.2 提取方法的選擇 以甲醇為溶劑，取供試品粉末約2 g，精密稱定分別用超聲提取和加熱回流提取2種方法提取，并按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明用超聲提取其提取率較高。

3.3 流動(dòng)相的選擇 分別以甲醇-水，甲醇-0.1 %醋酸水溶液，乙腈-水，乙腈-0.1 %醋酸水溶液為流動(dòng)相，更換流動(dòng)相比例，采用等度洗脫，均不理想。采用梯度洗脫，并乙腈-0.1 %醋酸水溶液為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)美迪紫檀素與其他成分分離效果較好。

3.4 檢查波長(zhǎng)的選擇 美迪紫檀素對(duì)照品溶液的3D高效液相圖譜顯示，其在200 nm和276 nm處有最大吸收，但200 nm處于紫外末端吸收，易導(dǎo)致圖譜基線漂移，故選擇276 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本研究首次建立了以美迪紫檀素為指標(biāo)成分的毛果魚(yú)藤藥材的RP-HPLC含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于毛果魚(yú)藤藥材的質(zhì)量控制。

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