水凝膠型防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT經(jīng)黏膜途徑免疫兔的實驗研究

管曉燕，李 敏，劉建國，李 虎，白國輝，肖茜文，張丁文，董競男

(1.遵義醫(yī)學院 口腔學院，貴州 遵義 563099；2.貴州省高等學校口腔疾病研究特色重點實驗室，貴州 遵義 563099)

齲病是由細菌引起的牙體硬組織的慢性感染性疾病，鏈球菌屬的變異鏈球菌是重要的致齲菌，葡萄基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferase, GTF)是其重要的毒力因子之一，也是主要的免疫抗原[1]。GTF的催化活性區(qū)(Catalytic, CAT)可以催化蔗糖水解酶的活性，使其產(chǎn)生葡聚糖，對變異鏈球菌在牙面的附著和齲病發(fā)生有著重要的作用。研究已經(jīng)證實，以GTF和GTF/ CAT為抗原免疫動物能夠有效地控制齲病發(fā)生。為了提高基因疫苗的免疫原性，增強免疫應(yīng)答，更好地保護宿主，選擇具有緩釋功能的遞送系統(tǒng)搭載基因疫苗已經(jīng)成為研究熱點，緩釋系統(tǒng)能夠保護疫苗本身的性質(zhì)不受破壞，為疫苗發(fā)揮作用提供了有利環(huán)境。課題組前期已成功構(gòu)建了防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT，制備了以溫敏型生物降解水凝膠PLGA-PEG-PLGA作為緩釋系統(tǒng)的水凝膠型防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT[2-3]。本實驗將該水凝膠型防齲基因疫苗經(jīng)口服和鼻腔黏膜滴注兩種途徑免疫新西蘭大白兔，觀察特異性抗體的動態(tài)變化及其在動物免疫部位的蛋白表達，分析水凝膠型防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT的免疫原性，為后續(xù)實驗提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔20只，雄性，普通級(購于第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK(渝)20070005)。

1.2 主要試劑及主要儀器 PLGA-PEG-PLGA(由電子科技大學微電子與固體電子學院郝建原教授提供)；鼠抗GTF多克隆抗體(課題小組前期制備)；辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG (美國Amresco公司)；辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgA(美國Genet公司)；SP法免疫組化試劑盒(博士德公司)；生物素標記的第二抗體(博奧生物公司)；變異鏈球菌GTF(課題小組前期分離純化)；重組質(zhì)粒pVAX1-gtfB/CAT(課題小組前期構(gòu)建)；空載體質(zhì)粒pVAX1(美國Invitogen公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Instruments.Inc公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)，柱式質(zhì)粒(大量)純化試劑盒(美國Omega公司)。

1.3 重組質(zhì)粒pVAX1-gtfB/CAT和空載體質(zhì)粒pVAX1的制備 采用柱式質(zhì)粒(大量)純化試劑盒按說明書制備重組質(zhì)粒pVAX1-gtfB/CAT和空載體質(zhì)粒pVAX1。

1.4 疫苗制備[3]分別準確稱量200 μg重組質(zhì)粒pVAX1-gtfB/CAT及空載質(zhì)粒pVAX1與0.8 mL 20%水凝膠混合，恒溫振蕩器振蕩過夜(100 r/min)，備用。

1.5 動物分組與免疫 20只新西蘭大白兔隨機分為5組，每組4只。分別為：A組：pVAX1-gtfB/CAT口服組，B組： pVAX1-gtfB/CAT鼻腔黏膜滴注組，C組：空載體pVAX1質(zhì)?？诜M，D組：空載體pVAX1+水凝膠口服組，G組：生理鹽水鼻腔黏膜滴注組。每間隔1周免疫1次，共3次。每次免疫質(zhì)粒劑量為200 μg/只。

1.6 樣本采集 唾液樣本的收集：將2%的硝酸毛果蕓香堿按照0.2 mg/100g的比例，注射入動物頸部皮下，采集唾液，離心，收集上清液，備用。血液樣本的收集：將兔子固定在固定器上，靜脈采血，離心，收集血清，備用。于免疫前和免疫后第1、2、3、4、6、8、10、12、14、16周采集動物血液及唾液樣本。組織切片制備：第3次免疫后每組處死1只動物，取小腸黏膜和鼻腔黏膜組織，常規(guī)石蠟包埋。

1.7 特異性抗體的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測特異性抗體水平。利用抗原包被緩沖液(PBS,pH9.6)將蛋白GTF稀釋成2.5 μg/mL包被96孔板，每孔100 μL；用3%BSA封閉各反應(yīng)孔，每孔200 μL，37 ℃濕盒孵育，2 h后棄去封閉液，分別將稀釋后的唾液(1∶2)和血清(1∶80)加到酶標板的各反應(yīng)孔中，每孔100 μL，用塑料保鮮膜封好微量酶標板，37 ℃濕盒孵育2 h；然后分別將辣根過氧化酶標記羊抗兔IgA(1∶1 250)和辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG(1∶4 000)加到酶標板各反應(yīng)孔中，每孔100 μL，用塑料保鮮膜封好，37 ℃濕盒孵育2 h向各反應(yīng)孔中加入TMB底物使用液，每孔100 μL，用塑料保鮮膜封好后，37 ℃濕盒中避光顯色25～30 min后，再向每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)，利用酶標儀測定各反應(yīng)孔OD450值。

1.8 目的蛋白表達的檢測 采用免疫組織化學染色SP法檢測目的蛋白的原位表達。將石蠟切片脫蠟；將載玻片放入盛有0.01M枸櫞酸鹽緩沖液的微波用塑料盒中放入微波爐中；洗片后每張切片加1滴3%過氧化氫去離子水，室溫孵育10 min后，每張切片加1滴正常非免疫動物血清，室溫放置15 min后，每張切片滴加(1∶50)的一抗(鼠抗GTF多克隆抗體：為本課題組前期制備)50 μL，4 ℃過夜；次日洗片后每張切片加1滴生物素標記的第二抗體，室溫10 min；洗片后每張切片滴加1滴鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，每張切片滴加30 μL DAB顯色，顯微鏡下控制染色，當組織或目標細胞陽性表達部位為深棕色或棕黃色時即可終止顯色，將片子沖洗脫水后封片。

2 結(jié)果

2.1 唾液中SIgA型抗GTF抗體水平 實驗組唾液中SIgA型抗GTF抗體水平在免疫后保持明顯上升趨勢，顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，第6周時達到最高峰，隨后開始下降。口服組和鼻腔黏膜滴注組抗體水平變化趨勢無明顯差異，提示口服和鼻腔黏膜滴注免疫對SIgA型抗GTF抗體在唾液中的免疫效果基本相同(見圖1)。

圖1 唾液中SIgA型抗GTF抗體水平

2.2 血清中SIgA型抗GTF抗體水平 免疫后血清中SIgA型抗GTF抗體水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在第3周至第12周保持相對較高水平?？诜M和鼻腔黏膜滴注組抗體水平有少許差異，但變化趨勢相似，提示口服和鼻腔黏膜滴注免疫對SIgA型抗GTF抗體在血清中的免疫效果基本相同(見圖2)。

圖2 血清中SIgA型抗GTF抗體水平

2.3 唾液中IgG型抗GTF抗體水平 免疫后各實驗組唾液中IgG型抗GTF抗體明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第6周抗體水平最高，隨后抗體水平開始緩慢下降。在第6、8、10周時，口服組和鼻腔黏膜滴注組抗體水平有一定差異，口服組高于鼻腔黏膜滴注組(見圖3)。

圖3 唾液中IgG型抗GTF抗體水平

2.4 血清中IgG型抗GTF抗體水平 免疫后實驗組血清中IgG型抗GTF抗體水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在第6、8、12、14周時，抗體水平有差異，但無統(tǒng)計學意義，不影響整體的變化趨勢。提示pVAX1-gtfB/CAT成功表達，使血清中IgG型抗GTF抗體水平變化明顯，效果顯著(見圖4)。

2.5 注射部位目的蛋白的表達 免疫組織化學檢測可見外源基因在口服組小腸黏膜的細胞胞漿內(nèi)和鼻腔黏膜滴注組鼻黏膜上皮下方的固有層中表達(見圖5)。

A ：pVAX1-gtfB/CAT口服組目的蛋白在小腸黏膜上皮細胞胞漿中的陽性表達；B： pVAX1口服組(對照組)目的蛋白在小腸黏膜上皮細胞胞漿中的陰性表達；C：pVAX1-gtfB/CAT鼻腔黏膜滴注組目的蛋白在鼻腔黏膜固有層結(jié)締組織成纖維細胞胞漿中的陽性表達；D：pVAX1鼻腔黏膜滴注組(對照組)目的蛋白在鼻腔黏膜固有層結(jié)締組織成纖維細胞胞漿中的陰性表達。圖5 目的蛋白的原位表達情況(SP法，×200)

3 討論

水凝膠是在空間結(jié)構(gòu)上呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的一類高分子材料，具有獨特的吸水和良好的生物相容性、藥物釋放的可控性、生物粘附作用和可降解等新型遞送系統(tǒng)所具備的優(yōu)點，目前在基因疫苗、功能性材料、組織工程等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在抗菌素、疫苗、避孕藥和激素等傳送藥物方面[4]。

水凝膠的最新發(fā)展方向是智能型水凝膠，包括溫度敏感型、pH 敏感型、溫度和pH雙重敏感型以及磁性響應(yīng)型等[5]。溫度敏感性水凝膠高分子材料對于溫度的變化具有非常高的敏感度，該凝膠具有最低臨界共溶溫度，其溶脹與收縮性隨溫度變化并不是呈線性，而是在某一溫度下水凝膠的體積表現(xiàn)為突然的收縮和膨脹。具體表現(xiàn)為在較低溫度下溶脹度較高，在相對較高溫度下溶脹度比較低。許多研究表明，將此類水凝膠作為藥物的緩釋系統(tǒng)，在機體不同溫度進行可控性釋放方面的研究具有非常重要意義。孫佳麗等[6]用化學方法得到了水溶性良好，同時在37 ℃時水凝膠溶膠向凝膠轉(zhuǎn)變的時間小于10min的改性材料CS-PEG；經(jīng)過體外釋藥實驗，發(fā)現(xiàn)該CS-mPEG水凝膠控釋作用較好，親水能力強，有助于保護蛋白活性不被破壞。吉秋霞等[7]制備CS-HTCC/GP溫敏水凝膠，通過檢測對牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和伴放線放線桿菌抑制作用，證實其不僅可作為藥物載體參與局部緩釋系統(tǒng)的組成， 同時可作為活性因子參與殺菌、抑菌，具有作為牙周局部用藥的潛力。本實驗所用的溫敏型可生物降解PLGA-PEG-PLGA水凝膠是三段嵌合共聚物形成的網(wǎng)狀體系，是利用材料空隙儲存藥物[4,8]。其在低于低臨界溶液溫度(Lower Critical Solution Temperature,LCST)時凝膠變?yōu)槿芤合啵哂谠摐囟葧r又由液相變?yōu)槟z狀，可以在凝膠液相時同基因疫苗混勻形成一個穩(wěn)定的緩釋體系，發(fā)揮緩釋作用，是比較理想的基因疫苗遞送系統(tǒng)。

口腔中抵抗齲病的抗體成分主要來源于黏膜免疫系統(tǒng)，如何使防齲疫苗有效激活黏膜免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生高滴度的特異性SIgA是研制防齲疫苗的關(guān)鍵[9]。由于黏膜免疫操作簡單以及同時可誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng)等優(yōu)點[10]，目前多數(shù)防齲疫苗采用鼻腔滴注、口服、灌胃、扁桃體噴霧等黏膜途徑進行免疫[11]。田源等[12]將表達外源目的蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄經(jīng)口服途徑免疫兔后，有效地誘導(dǎo)了動物唾液和血液特異性抗體的產(chǎn)生。岳朝暉等[13]將防齲基因疫苗pcDNA3-PAc經(jīng)鼻腔黏膜滴注途徑免疫BALB/c小鼠，有效地誘導(dǎo)了黏膜免疫應(yīng)答和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。課題組前期利用溫敏性水凝膠搭載防齲基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT免疫SD大鼠，發(fā)現(xiàn)疫苗在大鼠體內(nèi)可以起到緩釋作用，能夠有效地誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異性抗體，并在一段時間內(nèi)維持較高水平。齲齒記分分析表明，能夠有效抑制SD大鼠齲齒的發(fā)生[3]。

本實驗利用該水凝膠型防齲疫苗經(jīng)口服和鼻腔黏膜滴注兩種黏膜途徑免疫新西蘭大白兔，均有效地誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異性抗體，并且可以持續(xù)一段時間，提示該疫苗具有較好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫和黏膜免疫應(yīng)答,兩種黏膜免疫途徑都可能是該疫苗的有效免疫途徑。

重組質(zhì)粒pVAX1-gtfB/CAT經(jīng)口服和鼻腔黏膜滴注2種途徑免疫新西蘭大白兔后，觀察到免疫部位目的蛋白的表達，說明質(zhì)粒被攝取并經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程成功表達抗原蛋白分子。小腸黏膜的細胞胞漿中目的蛋白的表達可能與疫苗在M細胞中的定位吸收有關(guān)[14-15]。

水凝膠作為防齲疫苗的遞送系統(tǒng)，擁有其獨特的發(fā)展?jié)摿Γㄟ^口服或者鼻腔黏膜滴注免疫，其緩釋作用能夠做到比較平穩(wěn)的釋放藥物，達到一個長期的給藥過程。同時由于其良好的生物相容性，能較好的保護疫苗不被降解，從而提高藥物使用效率。但目前水凝膠的研究主要集中在制備工藝上，作為藥物控釋、傳輸?shù)睦碚摷皯?yīng)用研究還不夠深入，同時因為水凝膠力學性能差等方面的限制，要將水凝膠實際運用臨床還有待更加深入的研究，但作為口服防齲疫苗的搭載系統(tǒng)為齲病學者提供了新的研究方向。

[參考文獻]

[1] Smith D J. Dental caries vaccines：Prospects and concerns[J]. Expert RevVaccines, 2010, 9(1)：1-3.

[2] 曲云鵬，劉建國，楊德琴，等.變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶gtfB/CAT真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達[J].上?？谇会t(yī)學，2008，17(3)：289-292.

[3] 亓鵬.溫敏型生物降解水凝膠載體防齲基因疫苗不同途徑免疫SD大鼠的實驗研究[D].遵義：遵義醫(yī)學院,2011.

[4] 尹大偉，周英，劉玉婷，等.水凝膠的最新研究進展[J].化工新型材料，2012，40(2)：21-23.

[5] 陸晨，查劉生.智能納米水凝膠的刺激響應(yīng)性研究進展[J].功能高分子學報,2012,25(2):211-220.

[6] 孫佳麗，蔣國強，丁富新.殼聚糖-mPEG溫敏水凝膠載藥系統(tǒng)的制備及釋藥行為[J].清華大學學報:自然科學版，2010，50(6):909-912.

[7] 吉秋霞，鄧婧，于新波，等.殼聚糖基溫敏水凝膠對牙周常見致病菌的抑制作用[J].上?？谇会t(yī)學，2009，18(4)：397-400.

[8] 李虎，亓鵬，劉建國,等.遞送系統(tǒng)搭載防齲疫苗的研究現(xiàn)狀[J].醫(yī)學綜述,2014，20(9)：1555-1558.

[9] 劉開云，孫紅武，張衛(wèi)軍.變異鏈球菌防治藥物的研究現(xiàn)狀[J].國際口腔醫(yī)學雜志,2012,39(5):683-685.

[10] Matsumoto Y,Suzuki S,Nozoye T, et al. Oral immunogenicity and protective efficacy in mice of transgenic rice plants producing a vaccine candidate antigen (As16) of Ascarissuum fused with cholera toxin B subunit[J].Transgenic Res,2009,18(2):185-192.

[11] 許慶安.防齲疫苗[J].中國實用口腔科雜志,2012，5(10)：591-594.

[12] 田源，劉建國，白國輝，等.表達嵌合體蛋白PAcA/CTB的轉(zhuǎn)基因番茄口服免疫大白兔的實驗研究[J].口腔醫(yī)學研究，2013，29(3)：201-204.

[13] 岳朝輝，劉建國，王晶，等.防齲基因疫苗pcDNA3-PAc不同途徑免疫BALB/c小鼠的實驗研究[J].實用口腔醫(yī)學雜志，2010，26(2)：145-148.

[14] Sansonetti P J，Phalipon A.Mcell as ports of entry for enteroinvsive pathogens:mechanisms of interaction，concequences for the disease process[J].Semin Immunol，1999，11(3):193-203.

[15] 董競男，劉建國，白國輝，等. M 細胞——開啟黏膜免疫的“門戶”[J]. 國際免疫學雜志，2014，37(2)：101-104.