桑粉虱不同寄主植物田間群主要酶活性比較

江秀均 柴建萍 謝道燕 等

摘要：采用酶活力測定法，比較桑粉虱6種寄主植物（桑樹、黃瓜、煙草、菜豆、馬鈴薯、番茄）田間種群羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的變化。結(jié)果表明，6種植物粉虱種群乙酰膽堿酯酶活力馬鈴薯種群最高，煙草最低，且桑樹種群與其他種群相比差異顯著或極顯著；羧酸酯酶的活性是番茄種群最高，菜豆種群最低，桑樹粉虱種群與黃瓜和馬鈴薯種群相比差異不顯著，與番茄種群相比差異顯著或極顯著，與煙草和菜豆種群相比差異顯著；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性是桑樹種群最高，菜豆種群最低，桑樹種群顯著高于其他植物粉虱種群。

關(guān)鍵詞：桑粉虱；寄主植物；羧酸酯酶；乙酰膽堿酯酶；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶；酶活力

中圖分類號： S888.72文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0132-03

收稿日期：2013-09-10

作者簡介：江秀均（1981—），女，云南昭通人，助理研究員，主要從事桑樹病蟲害的研究。E-mail：jxjynbb@163.com。

通信作者：羅雁婕，博士，副研究員，主要從事桑樹病蟲害的研究。E-mail：yanjieluo@126.com。桑粉虱（Bemisia myricae Kuwana）隸屬昆蟲綱（Insecta）同翅目（Homoptera）粉虱亞目（Aleyromorpha）粉虱科，別稱白虱、楊梅粉虱，是近年來我國桑園的主要害蟲之一。近年來，云南蒙自地區(qū)大棚蔬菜得到快速發(fā)展，加上當?shù)鬲毺氐呐瑲夂颍７凼梢栽谏浼捌渌r(nóng)作物間交替轉(zhuǎn)移，全年危害，猖獗成災，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來較大的損失。據(jù)相關(guān)報道，桑粉虱的寄主有200余種，包括桑樹、黃瓜、菜豆、茄子、番茄、青椒、甘藍、馬鈴薯等多種蔬菜以及花卉和部分果實[1-2]。由于桑粉虱個體小，發(fā)育周期短，繁殖力強，世代重疊，易產(chǎn)生抗性，因而化學防治難以控制桑粉虱的危害。

昆蟲體內(nèi)保護酶是當昆蟲受到脅迫時，如不良環(huán)境、次生代謝物、抗性品種等產(chǎn)生的適應性酶系，被公認為與昆蟲的抗藥性有關(guān)[3-5]。羧酸酯酶（AchE）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTS）是害蟲體內(nèi)重要的解毒酶系，在對外源化合物的解毒代謝和殺蟲劑抗性機制中起重要作用[6]。乙酰膽堿酯酶是昆蟲體內(nèi)有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的靶標酶，昆蟲對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑抗性與乙酰膽堿酯酶的敏感性下降有關(guān)[7]，同時寄主植物本身也會影響取食寄主植物昆蟲體內(nèi)酶系的變化。因為不同寄主植物中所含的植物次生物質(zhì)種類不同，而有害植物次生代謝物質(zhì)可誘導昆蟲激活或抑制體內(nèi)相關(guān)解毒酶系，以加強昆蟲自身的保護作用，免受植物次生代謝物質(zhì)的危害[8]。目前，針對桑粉虱抗藥性研究較少，本研究以云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所的桑樹及桑園周邊間套作6種植物粉虱為研究對象，分析桑粉虱不同寄主植物田間種群的乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的差異，從生化水平上揭示桑粉虱抗性相關(guān)酶活性差異，確定桑粉虱在田間不同寄主植物上抗藥性的差異，為桑粉虱的綜合防治提供理論指導。

1材料與方法

1.1藥劑與儀器

1.1.1藥劑1-氯-2、4-二硝基苯（Sigma），堅固藍B鹽（Sigma-Aldrich），毒扁豆堿（Siyma），碘化硫代乙酰膽堿（Acros），5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（J&K 化學有限公司提供），牛血清蛋白、還原型型谷胱甘肽、1-萘乙酸等化學品購自云科生物工程公司。

1.1.2儀器BioMate 3雙光束紫外/可見光核酸蛋白分析儀，Sorvall Primo R臺式高速冷凍離心機和IMS-40（小型）雪花制冰機，恒溫水浴鍋。

1.2蟲源

桑樹（Morus alba L.） 品種云桑2號粉虱種群是2012年8月采自云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所內(nèi)的桑園，煙草粉虱種群2012年8月下旬采自草壩鎮(zhèn)13村桑園附近的煙草；番茄（Solanum lycopersicum）種群是2012年8月采自云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所試驗大棚周邊；馬鈴薯（Solanum tuberosum）種群8月采自云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所試驗大棚周邊的馬鈴薯地；黃瓜（Cucumis sativus Linn）和菜豆種群是6-8月采自桑園周邊種植的黃瓜苗和菜豆苗上。所采集的作物都是在桑園周邊20～500 m范圍內(nèi)，采樣期間番茄和煙草地塊用藥的頻率和劑量較高，采樣時是蠶期，桑園內(nèi)用藥較少，黃瓜、馬鈴薯和菜豆也沒用藥，距離桑園較近約20 m。

1.3桑粉虱不同寄主植物酶活性的測定

1.3.1活性測定酶活力的測定參照Gorun改進的Ellman方法[9]。取粉虱成蟲150頭，加入1.5 mL0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH值為7.5），冰浴勻漿，在 4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，取上清液作酶液。反應體系中依次加入 0.1 mol/L PBS、10 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿，工作酶液 100 μL，于27 ℃恒溫水浴5 min，加 0.125 mmol/L DTNB顯色劑，于412 nm處測D值，每個處理重復3次。根據(jù)D值和蛋白質(zhì)含量計算比活力。

1.3.2羧酸酯酶的酶活性測定酶活性測定參照何林等的方法[10-11]。先以α-萘酚量為自變量、D值為因變量作標準曲線。取粉虱150頭，加pH值為7.0的0.04 mol/L磷酸緩沖液1.5 mL，于冰水浴中勻漿，勻漿液于10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液稀釋20倍作為工作酶液。以 0.3 mmol/L α-萘酚含0.1 mmol/L毒扁堿）為底物加工作酶液1 mL混勻30 ℃恒溫水浴30 min，加顯色劑1 mL，靜置 15 min 后于 600 nm 處測D值。根據(jù)α-萘酚標準曲線和酶源蛋白質(zhì)含量，將D值換算成比活力[mmol/（mg·min）]。

1.3.3還原型谷胱甘肽的酶活性測定酶液活性的測定參照何林等的方法[10-11]。取粉虱150頭，加入66 mmol/L pH值7.0的磷酸緩沖液（含2 mmol/L EDTA），冰浴勻漿，勻漿液與10 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液稀釋10倍作為工作酶液。用0.03 mol/L CDNB作底物，經(jīng)GSTs作用，與還原型谷胱甘肽（1.0 mmol/L）反應生成硫醇尿酸衍生物，在 340 nm 處測D值。根據(jù)酶液蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果，將D值換算成比活力[mmol/（mg·min）]。

1.4蛋白質(zhì)含量的測定

參照Bradford的方法考馬斯亮藍G-250染色法測定[12]。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析都是在Excel和SPSS 17.0上進行的。

2結(jié)果與分析

2.1乙酰膽堿酯酶比活力測定

桑粉虱6種寄主植物乙酰膽堿酯酶的比活力以馬鈴薯種群最高，其次是菜豆、桑樹、番茄、黃瓜，煙草種群最低。桑樹種群乙酰膽堿酯酶同其他寄主植物粉虱種群相比差異極顯著；其他寄主植物粉虱種群間除了馬鈴薯與菜豆、黃瓜與煙草間差異不顯著外，其余植物種群之間均差異極顯著。

桑粉虱不同寄主植物AchE的比活力比較

寄主植物乙酰膽堿酯酶比活力

[mmol/（mg·min）]比值*差異顯著性5%1%馬鈴薯2.844 0±0.446 11.704aA菜豆2.621 2±0.164 21.570aA桑樹1.669 3±0.140 51.000bB番茄1.098 3±0.140 50.658cC黃瓜0.343 5±0.017 00.206dD煙草0.236 9±0.002 90.142dD注：*表示以寄主植物桑樹的值為1進行比較。

2.2羧酸酯酶比活力測定

桑粉虱不同寄主植種群羧酸酯酶比活力由高到低為番茄>煙草>黃瓜>桑樹>馬鈴薯>菜豆，番茄種群極顯著高于其他粉虱種群。桑樹粉虱種群與黃瓜和馬鈴薯種群相比差異不顯著，與番茄相比差異極顯著，與煙草和菜豆種群相比差異顯著。其他寄主植物種群間除煙草和黃瓜、馬鈴薯和菜豆差異不顯著外，其余種群間差異顯著。

2.3谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力測定

不同寄主植物粉虱種群谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的比活力以桑樹種群最高，其次是番茄、黃瓜、馬鈴薯、煙草，菜豆種群最低，桑樹種群是菜豆種群的2.2倍。桑樹種群除了與番茄種群間差異顯著外，與其他植物粉虱種群相比差異顯著或極顯著。其余植物種群間除了黃瓜和表2桑粉虱不同寄主植物CarE和GSTs的比活力

寄主植物羧酸酯酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活力

[mmol/（mg·min）]比值*差異顯著性5%1%比活力

[mmol/（mg·min）]比值*差異顯著性5%1%番茄0.2826±0.08422.907aA2.8845±0.10390.920bA煙草0.163 7±0.020 61.684bB1.872 2±0.045 90.597dC黃瓜0.104 2±0.007 41.072bcBC2.542 2±0.047 20.811cB桑樹0.097 2±0.004 91.000cBCD3.136 4±0.058 11.000aA馬鈴薯0.061 4±0.003 30.632cdCD2.453 5±0.275 80.782cB菜豆0.012 7±0.000 40.131dD1.418 6±0.128 90.452eD注：*表示以寄主植物桑樹的值為1進行比較。

馬鈴薯間種群間差異不顯著外，其他粉虱種群間差異顯著或極顯著。

3結(jié)論與討論

昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要機制是靶標酶敏感性降低和解毒酶活性增高。乙酰膽堿酯酶是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑殺螨劑的靶標，羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲體內(nèi)主要的解毒酶系。據(jù)報道，植物次生物質(zhì)可誘導、激活或抑制害蟲體內(nèi)與殺蟲劑抗性相關(guān)解毒酶系和靶標酶系，導致害蟲對藥劑的代謝酶活性或敏感性發(fā)生明顯改變[13]。王紅等報道，取食不同寄主植物的煙粉虱體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-還原酶活力均差異顯著[4，13-15]，表明寄主植物對煙粉虱解毒酶和保護酶活性均有誘導性；傅建煒等報道，取食不同寄主植物對黃曲條跳甲成蟲羧酸酯酶活性存在較大的影響[16]；高希武報道，由于寄主植物不同，棉蚜體內(nèi)羧酸酯酶活性也不同[17]；謝佳燕等報道，不同寄主植物會對取食的棉蚜乙酰膽堿酯酶活性產(chǎn)生影響[18]。本研究結(jié)果表明，不同寄主植物上桑粉虱乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性差異顯著，這可能是因為不同寄主植物田間用藥的水平及施藥種類，以及不同寄主植物體內(nèi)所含的植物次生代謝物的種類和植物組織營養(yǎng)狀態(tài)的影響，導致桑粉虱不同寄主植物種群解毒酶和靶標酶活性有明顯差異。

本研究分別比較了不同寄主植物上桑粉虱田間種群的CarE、GSTs和AchE的活性，發(fā)現(xiàn)桑粉虱體內(nèi)的2種解毒酶和1種靶標酶在不同寄主植物種群上表現(xiàn)出不同的變化趨勢。桑粉虱6種寄主種群中，馬鈴薯種群AchE活性最高，煙草種群最低；番茄種群CarE活性極顯著高于其他寄主種群；桑樹種群GSTs活性最高，菜豆種群最低，桑樹種群顯著高于其他種群?？赡苁怯捎诓煌参镌诤οx防治時施藥頻率和種類的不同，造成桑粉虱酶活性的差異；同時，桑粉虱取食不同的寄主植物，受植物的次生代謝物質(zhì)的影響，也會導致體內(nèi)解毒酶活性的變化；也可能受植物組織營養(yǎng)狀況的影響，使桑粉虱不同寄主種群解毒酶活性有明顯差異，以適應不同的寄主植物。具體是什么引起酶活性的差異，還有待進一步研究闡明。本研究結(jié)果可為桑粉虱綜合防控提供理論指導。

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