8株白僵菌菌株的抗逆性研究

滕忠才 劉廷輝 張立紅 董建臻 李瑞軍 李保國(guó)

摘要：對(duì)8個(gè)白僵菌（Beauveria bassiana）菌株的抗旱力、耐高溫能力、抗紫外線能力和耐低溫能力等生物學(xué)性狀進(jìn)行了測(cè)定，綜合各菌株的生物學(xué)特性和對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的毒力指標(biāo)，最終得出優(yōu)良菌株是BD-B026。

關(guān)鍵詞：小菜蛾；白僵菌；抗逆性；抗旱力；耐高溫能力；抗紫外線能力；耐低溫能力

中圖分類(lèi)號(hào)： S482.3+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0122-03

收稿日期：2013-12-29

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：12220302D）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系小麥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：滕忠才（1970—），男，河北獻(xiàn)縣人，碩士，講師，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)綜合防治研究。E-mail：teng-zhongcai@163.com。

通信作者：李瑞軍（1967—），男，河北昌黎人，博士，副教授，主要從事害蟲(chóng)生物防治及農(nóng)業(yè)生態(tài)安全研究。Tel：（0312）7528172；E-mail：liruijun99@sina.com。白僵菌作為一種重要的殺蟲(chóng)真菌，在國(guó)外已被開(kāi)發(fā)成為多種劑型并登記注冊(cè)[1-3]。隨著近十多年來(lái)絲孢類(lèi)生防真菌制劑技術(shù)的不斷發(fā)展，長(zhǎng)期困擾菌劑本身的生產(chǎn)、加工及應(yīng)用的很多技術(shù)難題都被有效解決[3-5]，使得越來(lái)越多的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）制劑用于農(nóng)林害蟲(chóng)的防治[4]。雖然能夠寄生多種昆蟲(chóng)，但不同菌株對(duì)寄主有一定的專(zhuān)化性，致病力也有一定的差異[5]，其致病力主要取決于菌株、害蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)以及環(huán)境條件等因素[6]。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是白僵菌屬中的一種，主要發(fā)生于包括鞘翅目和半翅目等絕大多數(shù)昆蟲(chóng)[7]，其有效成分是具有細(xì)胞生命特征的侵染體（分生孢子或菌絲體）。白僵菌菌株抗逆性的強(qiáng)弱在很大程度上決定著菌劑本身的生態(tài)適應(yīng)性和田間應(yīng)用效果。即使同一菌株在不同的寄主上也表現(xiàn)出不同的毒力，不同菌種或同一菌種的不同菌株在抗逆性方面往往存在較大的差異[8]，因而，篩選高毒力且抗逆性強(qiáng)的菌種菌株是提高生防菌劑技術(shù)含量和適用性的重要途徑之一。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：對(duì)小菜蛾高毒力的白僵菌菌株BD-B007、BD-B008、BD-B001、BD-B021、BD-B010、BD-B029、BD-B017、 BD-B026，均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自主分離。供試試蟲(chóng)：筆者所在實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)的小菜蛾2～3齡幼蟲(chóng)。培養(yǎng)基：SDAY固體培養(yǎng)基（葡萄糖4%，蛋白陳1%，酵母粉1%，瓊脂2%）；SDAY液體培養(yǎng)基（葡萄糖4%，蛋白陳1%，酵母粉1%）。營(yíng)養(yǎng)液：2%的葡萄糖和5%的蛋白胨。

1.2高毒力白僵菌菌株抗旱力的篩選

1.2.1高毒力白僵菌菌株抗旱力的測(cè)定取芽生孢子懸液，以SDAY液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入10%的PEG200（聚乙二醇，分子量6 000），在（25±1） ℃下培養(yǎng)，測(cè)其萌發(fā)中時(shí)GT50′；以未加PEG200的菌液為對(duì)照，測(cè)定其萌發(fā)中時(shí)GT50。以GT50′與GT50之差作為孢子耐干旱能力的大小，每次測(cè)定各菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)（萌發(fā)液試管3支）。

1.2.2干旱脅迫下高毒力白僵菌菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定取芽生孢子懸液，以SDAY液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入5%、10%、20%、30%、40%的PEG200，以未加PEG200處理為對(duì)照，（25±1） ℃下培養(yǎng)12 h，于8 000 r/min離心10 min，棄上清液。孢子用滅菌水洗滌2次，同上離心，用0.05% Tween-80 分別配制成含孢子1×106個(gè)/mL的懸液，然后用直徑7 mm的濾紙圓片浸沒(méi)于孢子懸液中，再取出置于直徑 9 cm 的SDAY平板中央，然后置于（25±1） ℃的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 7 d，每處理重復(fù)3次，逐日測(cè)量各平板上的菌落直徑。

1.3高毒力白僵菌菌株抗紫外線能力的篩選

將各菌株的芽生孢子懸浮液（40～120個(gè)/μL）在室內(nèi)紫外燈（30 W）下60 cm處照射0、0.5、1、2、4、6 min，吸取上述各處理的孢子懸浮液1 μL，均勻涂布于SDAY平板上，將平板置于 （25±1） ℃ 溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng) 5 d 后計(jì)數(shù)各處理平板中菌落數(shù)，以未經(jīng)處理的為對(duì)照，計(jì)算各菌株各處理的菌落死亡率，表示分生孢子的死亡率。

1.4高毒力白僵菌菌株耐高溫能力的篩選

1.4.1短時(shí)高溫處理對(duì)分生孢子的影響將芽生孢子懸浮液分裝至試管，置于水浴鍋恒溫處理，處理溫度設(shè)置：35、40、50、60、70 ℃，處理時(shí)間設(shè)置：10、20、30、40、50、60 min，以不加溫處理為對(duì)照，3次重復(fù)。然后將處理的分生孢子分別：（a）轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)液，于26 ℃搖床恒溫培養(yǎng)18～24 h，顯微鏡下觀察5～10個(gè)視野，約500個(gè)孢子，計(jì)萌發(fā)率；（b）涂布于SDAY平板，25 ℃培養(yǎng)3 d，計(jì)成菌落數(shù)。

1.4.2持續(xù)高溫培養(yǎng)對(duì)分生孢子的影響將芽生孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)液，分裝至試管，置于水浴鍋35、40、50、60、70 ℃ 恒溫培養(yǎng)3～4 d，以25 ℃培養(yǎng)為對(duì)照，3次重復(fù)。涂布于SDAY平板，計(jì)成菌落數(shù)。

1.5高毒力白僵菌菌株耐低溫能力的篩選

1.5.1高毒力白僵菌菌株低溫下萌發(fā)率的測(cè)定取芽生孢子懸浮液，轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)液，分裝至試管，在（15±1） ℃下培養(yǎng)，測(cè)定其萌發(fā)率。

1.5.2各菌株低溫下生長(zhǎng)量的測(cè)定取芽生孢子懸液 10 μL，滴于SDAY平板中央，每菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，置 （25±1） ℃ 培養(yǎng)7 d，逐日測(cè)量菌落直徑。

2結(jié)果與分析

2.1高毒力白僵菌菌株抗旱力的篩選

2.1.1高毒力菌株抗旱力的測(cè)定由表1可知，經(jīng)不同濃度PEG200處理后，對(duì)不同菌株孢子萌發(fā)產(chǎn)生的影響不同。其中BD-B026菌株的抗旱力最高，對(duì)其孢子萌發(fā)的影響最?。籅D-B017菌株次之，對(duì)BD-B007菌株影響最大。

2.1.2干旱脅迫下高毒力菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定由表2可知，不同菌株經(jīng)不同濃度PEG200處理后，對(duì)孢子產(chǎn)生的影響隨PEG200處理濃度的增大而增加。當(dāng)處理濃度為20%時(shí)，各

菌株與未經(jīng)PEG200處理間差異較明顯。當(dāng)處理濃度為40%時(shí)，各菌株之間存在顯著性差異。其中40%PEG200對(duì) BD-B029 的抑制率最高，BD-B021次之，BD-B026最小。表2不同菌株生長(zhǎng)抑制率

菌株生長(zhǎng)抑制率0%PEG200（CK）5%PEG20010%PEG20020%PEG20030%PEG20040%PEG200BD-B0260.00aA0.00aA0.01abA0.02abA0.03abA0.08bABD-B0100.00aA-0.02aA0.03abA0.01abA0.03abA0.10bABD-B0080.00aA0.00aA0.03aA0.05aA0.12aA0.13aABD-B0010.00aA0.00aA0.02aA0.04aAB0.12bBC0.14bCBD-B0170.00aA0.01abA0.04bcA0.07bcAB0.10cAB0.14dBBD-B0210.00aA0.00aA0.01bcAB0.10cABC0.15cdBC0.17dCBD-B0070.00aA-0.02aA0.00aA0.03aA0.09abAB0.18bBBD-B0290.00aA0.03aA0.05aA0.07aA0.17bAB0.21bB注：同行不同小寫(xiě)、大寫(xiě)字母表示差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）。

2.2高毒力白僵菌菌株抗紫外線能力的篩選

不同菌株孢子經(jīng)紫外光照射后，均對(duì)孢子產(chǎn)生影響，隨紫外照射時(shí)間的增加而增大，且與未經(jīng)照射孢子的萌發(fā)率之間均存在顯著性差異。各菌株孢子間致死中時(shí)差異較明顯（表3）。經(jīng)紫外線照射后，其中BD-B008菌株孢子活率最低，對(duì)孢子的影響最大；BD-B007菌株次之，對(duì)BD-B17菌株影響最小。

2.3高毒力白僵菌菌株耐高溫能力的篩選

2.3.1短時(shí)高溫處理對(duì)分生孢子的影響溫度通常關(guān)系到白僵菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的速度，以及致病率的高低。尤其是高溫，35 ℃是白僵菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的極限溫度[9]。因此，孢子耐熱性能是篩選優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)之一，耐熱性好表明菌株在野外抵抗高溫的能力強(qiáng)。8個(gè)供試菌株經(jīng)高溫水浴處理后，18～24 h后孢子萌發(fā)結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

菌株致死中時(shí)（min）回歸方程BD-B0171.67±0.02 y=1.186 9+3.117 8xBD-B0101.04±0.03y=2.470 0+2.482 9xBD-B0260.77±0.04y=3.461 2+1.736 8xBD-B0290.64±0.04y=3.790 0+1.503 2xBD-B0010.63±0.05y=4.085 6+1.146 8xBD-B0210.58±0.03y=3.033 7+2.577 3xBD-B0070.47±0.03y=3.612 1+2.059 9xBD-B0080.06±0.08y=5.170 4+0.936 6x

2.3.1.135 ℃熱脅迫對(duì)分生孢子的影響35 ℃處理后與對(duì)照有差異，得到的成菌落數(shù)均比觀察到的發(fā)芽率略低，但熱處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)發(fā)芽率和成菌落數(shù)的影響趨勢(shì)基本相同（表4）。表4不同菌株分生孢子經(jīng)35 ℃恒溫水浴不同時(shí)間脅迫處理后的死亡率

菌株死亡率0 min10 min20 min30 min40 min50 min60 minBD-B0260.00aA0.03abAB0.06abcABC0.10abcdABC0.13bcdABC0.16cdBC0.19dCBD-B0170.00aA0.03abA0.11abcAB0.18bcAB0.21bcAB0.22cAB0.29cBBD-B0290.00aA0.08abA0.20abA0.23abA0.28abA0.31bA0.32bABD-B0080.00aA0.11abAB0.16abcAB0.21abcAB0.27bcAB0.33cB0.37cBBD-B0100.00aA0.02aA0.17bB0.23cC0.37dD0.46eE0.55fFBD-B0070.00aA0.10bB0.18cB0.31dC0.46eD0.52eD0.62 fEBD-B0010.00aA0.44abAB0.49abcAB0.52abcAB0.55bcAB0.59cB0.65cBBD-B0210.00aA0.32bB0.38cB0.52cB0.66dC0.69eD0.86fE注同表3。

菌株半致死時(shí)間

（LT50）（min）回歸方程BD-B026126.88±0.05y=2.543 5+1.167 9xBD-B01793.85±0.04y=2.516 5+1.259 1xBD-B02953.49±0.02y=0.456 4+2.629 0xBD-B01052.57±0.03y=2.272 1+1.585 3xBD-B00837.34±0.03y=1.986 3+1.916 9xBD-B00736.48±0.03y=2.070 3+1.875 5xBD-B00123.39±0.03y=2.507 6+1.820 6xBD-B02115.77±0.05y=3.491 2+1.259 7x

2.3.1.240 ℃熱脅迫對(duì)分生孢子的影響孢子的萌發(fā)在此溫度下非常敏感，敏感程度依次為：BD-B026、 BD-B17、BD-B029、BD-B010、BD-008、BD-B007、 BD-B001、 BD-B021（表5）。BD-B021在處理10 min時(shí)，發(fā)芽率下降了32%。BD-B010和BD-B001對(duì)短時(shí)熱處理有一定的忍耐力，當(dāng)處理10 min時(shí)，發(fā)芽率與對(duì)照無(wú)顯著差異，BD-B026 與其他菌株比較耐受能力較強(qiáng)，但處理時(shí)間為30 min時(shí)，發(fā)芽率也下降至21%以下。另外，成菌落數(shù)均比觀察到的發(fā)芽率略低，但熱處理時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)發(fā)芽率和成菌落數(shù)的影響趨勢(shì)基本相同。

50 ℃、60 ℃和70 ℃處理對(duì)孢子萌發(fā)有很大抑制作用，各處理時(shí)段的發(fā)芽率均為0。

2.3.2持續(xù)高溫處理對(duì)分生孢子的影響試驗(yàn)結(jié)果表明各菌株在各溫度培養(yǎng)3～ 4 d均未形成菌落。

2.4高毒力白僵菌菌株耐低溫能力的篩選

2.4.1高毒力菌株耐低溫能力的測(cè)定結(jié)果不同菌株經(jīng)低溫處理，由于各菌株對(duì)低溫的耐性不同，菌株之間存在十分明顯的差異性。經(jīng)低溫處理48 h，BD-B008菌株孢子的萌發(fā)率最高，對(duì)孢子的影響最小，孢子萌發(fā)一半所需要的時(shí)間最短，對(duì)BD-B029菌株影響最大，孢子萌發(fā)一半所需時(shí)間最長(zhǎng)。

菌株萌發(fā)中時(shí)（min）回歸方程BD-B00834.47±0.02y=0.012 7+3.243 9xBD-B01036.15±0.02y=0.347 2+2.986 1xBD-B00737.78±0.02y=-0.139 1+43.258 2xBD-B01738.71±0.02y=0.217 8+3.011 7xBD-B00139.41±0.02y=0.456 3+2.847 7xBD-B02139.89±0.02y=-0.017 7+3.134 4xBD-B02639.01±0.02y=-0.068 7+3.185 5xBD-B02949.40±0.02y=10.461 6+2.679 5x

2.4.2各菌株低溫下生長(zhǎng)量的測(cè)定結(jié)果菌株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)快慢是反映菌株優(yōu)良性狀的指標(biāo)之一。8個(gè)白僵菌菌株在SDAY 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)有明顯的差異（表7） 。7 d時(shí)菌落生長(zhǎng)直徑從11～1.4 cm不等，其中菌株BD-B008和BD-B001生長(zhǎng)最快，BD-B021生長(zhǎng)最慢。表7不同菌株低溫下的菌落直徑

菌株菌落直徑（cm）1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 dBD-B0080.00aA0.56aA0.70aA0.88aA1.05aA1.18aA1.40aABD-B0010.00aA0.55aA0.70abA0.90abA1.00abAB1.20aA1.38abABBD-B0170.00aA0.60aA0.70abcA0.75abcAB0.83bcABC1.20aA1.33bcABCBD-B0070.00aA0.53aA0.65abcA0.73abcAB0.85cdBC0.95aA1.23bcdABCBD-B0260.00aA0.53aA0.75abcA0.78bcAB0.85cdBC1.05aA1.22bcdABCBD-B0290.00aA0.50aA0.60abcA0.70cAB0.80cdBC1.10aA1.20bcdABCBD-B0100.00aA0.53aA0.67bcA0.81cAB0.93cdC1.10aA1.15cdBCBD-B0210.00aA0.53aA0.62cA0.76cB0.85dC0.95aA1.10dC

2.5綜合評(píng)判白僵菌菌株的生物學(xué)性狀指標(biāo)

綜合評(píng)判8個(gè)白僵菌菌株的抗旱能力、耐熱能力、抗紫外線能力和耐低溫能力等生物學(xué)指標(biāo)（表8）。從表8可知，對(duì)生物學(xué)性狀指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)后，BD-B017、BD-B010和BD-B026分別位列前3位，綜合對(duì)小菜蛾的毒力考慮菌株BD-B026為首選開(kāi)發(fā)菌株。表8不同菌株生物學(xué)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)

菌株抗旱能力抗旱生長(zhǎng)

抑制率耐熱能力抗紫外能力紫外生長(zhǎng)

抑制率耐低溫能力抗旱生長(zhǎng)量綜合排序BD-B017242124318BD-B026181357530BD-B010474242730BD-B007826713431BD-B029313478632BD-B008765861134BD-B021538636839BD-B001657585238

3結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，不同菌株間抗逆性存在顯著差異，同一菌株對(duì)不同條件的抗逆性也不相同。表明白僵菌孢子的穩(wěn)定性除與溫度、光照和濕度有關(guān)，還與孢子自身有關(guān)，所以今后在進(jìn)行抗性育種和環(huán)境監(jiān)測(cè)時(shí)，必須考慮這些因素，從而可以有效地預(yù)測(cè)孢子在環(huán)境中的宿存時(shí)間和數(shù)量，為防治策略的制定提供參考依據(jù)。綜合考慮各項(xiàng)指標(biāo)，BD-B017、BD-B010 和BD-B026有較大的生產(chǎn)應(yīng)用潛力，這3個(gè)菌株的抗旱力、抗寒力、耐熱力、抗紫外線能力等生物學(xué)特性，綜合

排序位居前列，但菌株BD-B017對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的毒力相對(duì)較低，最終得出防治小菜蛾幼蟲(chóng)優(yōu)良菌株是BD-B026菌株。

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