利用玉米秸稈制備木霉菌可濕性粉劑

田連生 劉鳳云 沙建

摘要：采用玉米秸稈粉固體發(fā)酵法制備木霉菌孢子粉，并利用正交試驗(yàn)篩選出最佳的固體培養(yǎng)基配比：100%秸稈粉+20%葡萄糖+0.5%（NH4）2SO4+0.02%KH2PO4+150%水。通過(guò)木霉菌T21與各助劑的生物相容性試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，篩選出木霉菌可濕性粉劑配方：50%木霉孢子粉+2%MK20+2%拉開(kāi)粉+46%高嶺土。制成產(chǎn)品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合Q/BASW 02—2006《木霉菌可濕性粉劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。

關(guān)鍵詞：木霉菌；生物相容性；可濕性粉劑

中圖分類(lèi)號(hào)： S183；S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0116-03

收稿日期：2013-09-03

基金項(xiàng)目：江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：2012JSSPITP4029）。

作者簡(jiǎn)介：田連生（1962—），男，河北保定人，教授，從事生物農(nóng)藥及生物降解方面的研究工作。Tel：（0514）85433018；E-mail：lianshengt@163.com。自1932年Weindling發(fā)現(xiàn)木霉菌對(duì)植物病原菌具有拮抗作用以來(lái)，各國(guó)科學(xué)家從多方面展開(kāi)了對(duì)木霉菌的生防研究工作[1-4]。木霉菌（Trichoderma spp.）屬半知菌類(lèi)，具有廣譜性、安全性和很強(qiáng)的適應(yīng)性，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、抗生性以及誘導(dǎo)植物的抗性作用機(jī)制[5-6]而對(duì)多種植物病原菌如腐霉屬（Pythium）、鐮孢屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、絲核菌屬（Rhizhotonia）、葡萄孢屬（Botrytis）等有很強(qiáng)的抑制作用；同時(shí)木霉菌能防治多種植物病害，而不會(huì)對(duì)環(huán)境與人類(lèi)健康造成影響。由于木霉菌具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)孢量大、病原菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，目前已被國(guó)內(nèi)外廣泛用于防治植物的真菌性病害。以色列Makhteshim Agan公司開(kāi)發(fā)的以哈茨木霉T39菌株為發(fā)酵液的生防制劑（Trichodex），為 25%可濕性粉劑，可以用于防治灰霉病、苗枯病、霜霉病和白粉病等葉部病害及果實(shí)在儲(chǔ)藏期的腐爛；在美國(guó)，利用哈茨木霉防治由腐霉菌引起的蔬菜根腐病也取得了很好的效果。本研究試圖以玉米秸稈為原料，通過(guò)固體發(fā)酵制備木霉孢子粉，再配以適量的潤(rùn)濕劑、分散劑和載體等農(nóng)藥助劑來(lái)研制木霉可濕性粉劑。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，秸稈資源豐富，每年的秸稈產(chǎn)量5.7億～60億t，以廢棄的農(nóng)作物秸稈為原料既可以降低木霉菌劑的生產(chǎn)成本又可以減少農(nóng)作物秸稈焚燒而造成的環(huán)境污染，從而為農(nóng)作物秸稈的綜合利用提供了一條新途徑。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

拮抗性木霉菌（Trichoderma spp.）T21，由筆者所在單位從多地采集的土樣中分離、純化后經(jīng)過(guò)與灰霉菌、立枯絲核菌等病原菌的對(duì)峙培養(yǎng)篩選得到。

分散劑：MK20、NNO、S50，安陽(yáng)助劑廠；潤(rùn)濕劑：拉開(kāi)粉、十二烷基苯磺酸鈉、MF，邢臺(tái)藍(lán)天精細(xì)化工有限公司；載體：硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣、高嶺土，安徽碭山助立特農(nóng)用農(nóng)藥助劑廠。

1.2種子液培養(yǎng)

取100 mL種子液培養(yǎng)基放入250 mL三角瓶中，滅菌后接入拮抗性木霉菌T21，于25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，作為種子液備用。

種子液培養(yǎng)基（1 L）：2%玉米粉，2%葡萄糖，0.1%（NH4）2SO4，0.1%KH2PO4，補(bǔ)足水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為6。

1.3固體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

以來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉易得的玉米秸稈粉作為固體培養(yǎng)基原料，設(shè)計(jì)以玉米秸稈粉、水、葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽為影響因子的4因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

按照上述正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，先稱取10 g秸稈粉（過(guò)20目）于250 mL三角瓶中，然后將葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽融入水中，再將溶液放入三角瓶中與秸稈粉混合均勻，滅菌冷卻后接入10%種子液，攪拌均勻后于25 ℃恒溫培養(yǎng)6 d。分別取5 g各處理發(fā)酵物，于80 ℃干燥6 h后準(zhǔn)確稱取1.0 g放入100 mL帶玻璃珠的三角瓶中，于200 r/min振蕩30 min，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定固體發(fā)酵物中的木霉菌分生孢子數(shù)。每處理重復(fù)3次，按最佳固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配比進(jìn)行發(fā)酵，制備木霉菌孢子粉。

1.4助劑與木霉菌相容性的測(cè)定

由于木霉菌分生孢子為生物活體，因此在篩選各農(nóng)藥助劑時(shí)，除了要考慮各助劑對(duì)可濕性粉劑的理化性能外，還應(yīng)該考慮篩選助劑與分生孢子的生物相容性以及是否對(duì)分生孢子的萌發(fā)產(chǎn)生影響[7]。

1.4.1菌落生長(zhǎng)的測(cè)定將PDA培養(yǎng)基加熱融化并放至 40～45 ℃ 時(shí)，分別加入一定量的載體、分散劑和潤(rùn)濕劑，使總濃度達(dá)到100 mg/L，然后將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，制成藥物培養(yǎng)基。用打孔器截取直徑為45 mm的T21木霉菌菌塊并接入上述藥物培養(yǎng)基的中央，于25 ℃恒溫培養(yǎng)46 h，用“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑并記錄。每處理重復(fù)3次。并以不加助劑的PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.4.2孢子萌發(fā)測(cè)定取適量木霉菌孢子粉，用無(wú)菌水配成1.5×103 CFU/L的分生孢子懸浮液，取0.1 mL均勻涂布在上述各藥物培養(yǎng)基表面，于25 ℃恒溫培養(yǎng)50 h，觀察分生孢子萌發(fā)形成的菌落數(shù)，每處理重復(fù)3次；用空白PDA培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

1.5助劑的配比篩選

木霉菌可濕性粉劑的配制是以木霉菌孢子粉為基礎(chǔ)，再加入適量的分散劑、潤(rùn)濕劑和載體復(fù)配而成的[8-9]。其中分散劑和潤(rùn)濕劑是2個(gè)最主要的助劑，它們的種類(lèi)和加入量對(duì)可濕性粉劑的理化性能、防治效果和穩(wěn)定性有很大影響。各因素水平的正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

比例（%）B：2%分散劑C：2%潤(rùn)濕劑D：46%載體130MK20MF硅藻土240NNO十二烷基磺酸鈉 高嶺土350S50拉開(kāi)粉輕質(zhì)鈣

通過(guò)測(cè)定正交試驗(yàn)中各處理的潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率，篩選出最佳可濕性粉劑所用助劑類(lèi)型和配方。其中潤(rùn)濕時(shí)間按照GB/T 5451—2001《農(nóng)藥可濕性粉劑潤(rùn)濕性測(cè)定方法》進(jìn)行測(cè)定，懸浮率按照GB/T 14825—2006《農(nóng)藥懸浮率測(cè)定方法》進(jìn)行測(cè)定。

1.6木霉菌可濕性粉劑的配制

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果篩選出的最佳配方，分別按比例稱取木霉菌孢子粉、分散劑、潤(rùn)濕劑、載體，充分混和后用高速氣流粉碎機(jī)粉碎成325目大小，再用混合器混勻，按Q/BASW02—2006《木霉可濕性粉劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行產(chǎn)品抽樣檢測(cè)，合格后包裝為成品。

2結(jié)果與分析

2.1固體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

以價(jià)格低廉易得的玉米秸稈粉為固體培養(yǎng)基的主要原料，設(shè)計(jì)了以玉米秸稈粉、葡萄糖、水、無(wú)機(jī)鹽為影響因子的4因素3水平正交試驗(yàn)，測(cè)定產(chǎn)孢量。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

可以看出：各因子對(duì)固體發(fā)酵物的產(chǎn)孢量影響效果依次為：A>B>D>C。即：秸稈粉含量>含水量>葡萄糖含量>（NH4）2SO4+KH2PO4含量。產(chǎn)孢量最大的組合是A3B2C3D1，此組合不在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，但與之部分相同的A3B2C1D3組合的產(chǎn)孢量最高，為為12.90×109個(gè)/g，可認(rèn)為最佳固體培養(yǎng)基（重量比50%）為：100%秸稈粉，20%葡萄糖，0.5%（NH4）2SO4+0.02%KH2PO4，150%水。

2.2菌落生長(zhǎng)的測(cè)定

在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46 h后用“十”字交叉法測(cè)量各處理木霉菌落直徑平均值，見(jiàn)圖1。可以看出，木霉菌T21的生長(zhǎng)基本不受拉開(kāi)粉、MK20和高嶺土的影響，其中拉開(kāi)粉反而會(huì)對(duì)木霉菌的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用；S50、MF對(duì)木霉菌等的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。研究結(jié)果為潤(rùn)濕劑和分散劑的篩選提供了參考。

2.3孢子萌發(fā)的測(cè)定

的試驗(yàn)結(jié)果表明：高嶺土、MK20的孢子萌發(fā)數(shù)與空白對(duì)照相比基本無(wú)差異，拉開(kāi)粉對(duì)木霉菌T21有一定的促進(jìn)作用；S50、MF的孢子萌發(fā)數(shù)明顯低于對(duì)照處理。本結(jié)果與菌落生長(zhǎng)結(jié)果一致，表明高嶺土可以作為木霉菌可濕性粉劑的載體，拉開(kāi)粉可以作為潤(rùn)濕劑，MK20可以作為分散劑。

2.4助劑的配比篩選

以正交試驗(yàn)各處理測(cè)定的潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各配方進(jìn)行測(cè)定和評(píng)價(jià)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4中的極差R（懸浮率）數(shù)據(jù)可見(jiàn)：影響懸浮率的因素為A>D>C>B，即對(duì)懸浮率影響的次序分別為：孢子粉、載體、潤(rùn)濕劑、分散劑。懸浮率最佳的配比為A2B2C1D2，即40%孢子粉、2% NNO、2%MF、46%高嶺土，但表中無(wú)此組合；A2B3C1D2組合的懸浮率可達(dá)到60%，但其中的S50對(duì)木霉菌生長(zhǎng)有抑制作用；此外，A3B1C3D2組合的懸浮率可達(dá)586%，與60%差距不大。

極差R（濕潤(rùn)時(shí)間）的數(shù)據(jù)可見(jiàn)：影響潤(rùn)濕時(shí)間的因素大小分別為A>D>B>C，即對(duì)潤(rùn)濕時(shí)間影響的次序分別為：孢子粉、載體、分散劑、濕潤(rùn)劑。潤(rùn)濕時(shí)間的最佳配比為：A1B3C2D3，即30%孢子粉、2%S50、2%十二烷基磺酸鈉、46%

各處理的正交試驗(yàn)結(jié)果L9（34）

處理號(hào)因素ABCD懸浮率

（%）潤(rùn)濕時(shí)間

（s）1111146.5168.52122247.9150.73133339.7200.14212350.3133.15223156.898.26231260.095.47313258.690.08321353.6120.99332151.7131.6K1（懸浮率）134.1155.4160.1155.0K2（懸浮率）167.1158.3149.9166.5K3（懸浮率）163.9151.4155.1143.6R（懸浮率）33.06.910.222.9K1（濕潤(rùn)時(shí)間）519.3391.6384.8398.3K2（濕潤(rùn)時(shí)間）326.7369.8415.4336.1K3（濕潤(rùn)時(shí)間）342.5427.1388.3454.1R（濕潤(rùn)時(shí)間）192.657.330.6118.0

輕質(zhì)鈣，但表中無(wú)此組合；A3B1C3D2組合條件的潤(rùn)濕時(shí)間可達(dá)90 s，因此木霉可濕性粉劑的最佳配方選擇A3B1C3D2，即50%木霉孢子粉、2%MK20、2%拉開(kāi)粉、46%高嶺土。

2.5木霉菌可濕性粉劑的質(zhì)量檢測(cè)

采用Q/BASW 02—2006《木霉菌可濕性粉劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行抽樣檢測(cè)，表5結(jié)果表明各項(xiàng)指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)。表5木霉菌可濕性粉劑的檢測(cè)結(jié)果

類(lèi)別木霉活孢子數(shù)

（個(gè)/g）懸浮率

（%）水分

（%）pH值細(xì)度（通過(guò)44 μm

試驗(yàn)篩）（%）潤(rùn)濕時(shí)間

（s）加速貯存試驗(yàn)[（54+2） ℃，14 d]

失活率（%）標(biāo)準(zhǔn)≥2.0×108≥80.05±16.0～7.0≥95≤120≤20.0測(cè)量數(shù)2.6×10880.156.29611519.8

3結(jié)論

經(jīng)正交試驗(yàn)篩選出了最佳固體培養(yǎng)基：100%秸稈粉，20%葡萄糖，0.5%（NH4）2SO4，0.02%KH2PO4，150%水。

生物相容性試驗(yàn)表明：高嶺土可作為木霉菌可濕性粉劑的載體，拉開(kāi)粉可作為潤(rùn)濕劑，MK20可作為分散劑，而S50、MF對(duì)木霉T21的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

助劑配比正交試驗(yàn)篩選出最佳的木霉可濕性粉劑配方為：50%木霉孢子粉、2%MK20、2%拉開(kāi)粉、46%高嶺土。

綜合試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)配制的木霉菌可濕性粉劑各項(xiàng)指標(biāo)均符合Q/BASW02—2006《木霉菌可濕性粉劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。

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