煙草青枯病菌土壤拮抗細菌的篩選及鑒定

陸錚錚+蔣選利

摘要：為篩選出煙草青枯病菌的拮抗細菌，從貴州省天柱縣、黃平縣及大方縣煙草根圍土壤中共分離出65株細菌。采用平板噴霧法篩選獲得20株拮抗細菌，且抑制效果穩(wěn)定，其中有2株拮抗細菌平均抑菌圈直徑大于20 mm，分別為C3-5（39.98 mm）和C5-3（48.88 mm）。采用16S rDNA序列分析以及形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、染色結(jié)果等方法進行鑒定，結(jié)果顯示，C3-5為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），C5-3為球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericu）。

關(guān)鍵詞：煙草青枯?。晦卓辜毦?；生物防治；篩選；鑒定；蠟樣芽孢桿菌；球形賴氨酸芽孢桿菌

中圖分類號： S435.72文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0099-03

收稿日期：2013-09-22

基金項目：中國煙草總公司貴州省公司科技項目（編號：200917）；貴州銅仁地區(qū)煙草公司項目[編號：貴銅煙（2009）10]。

作者簡介：陸錚錚（1986—），女，碩士，助教，研究方向為植物病害生物防治。E-mail：luzheng_zheng@126.com。

通信作者：蔣選利，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為分子植物病理學(xué)。E-mail：jxl3237@163.com。青枯病病原菌原名為茄假單胞桿菌（Pseudomonas solanacearum E. F. Smith），1995年更改為茄勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum E. F. Smith）[1]。煙草青枯病是一種典型的維管束細菌性土傳病害，最顯著的癥狀是枯萎。該病害廣泛分布于熱帶、亞熱帶等50多個國家和地區(qū)，在我國南方普遍存在且危害嚴重，它具有發(fā)病快、危害重、損失大等特點，且常與黑脛病和空莖病混合發(fā)生[2]，給防治帶來了較大的困難。目前，對于煙草青枯病的防治還是以化學(xué)防治為主，近幾年研究者們篩選出了許多對煙草青枯病有較好抑制效果的藥劑，如30.2%芽敵水劑[3]、72%農(nóng)用硫酸鏈霉素[4]以及1 B°石硫合劑[5]等藥劑。但是化學(xué)農(nóng)藥會對環(huán)境造成污染，威脅人畜的健康和安全，且隨著施用年限和濃度的增加，易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。隨著煙草青枯病防治研究的不斷深入，生物防治已成為防治該病害的研究熱點，尤其是通過篩選根圍土壤中的拮抗菌與病原菌競爭營養(yǎng)和生存空間的方法，降低病原菌的繁殖率，從而有效控制病害，且對環(huán)境無污染，是一種綠色的防治方法。土壤是一切自然環(huán)境中細菌的總發(fā)源地，在土壤中存在著許多對人類有益的細菌，它們具有分解或者合成的作用，是人類的功臣[6]?？梢哉f，土壤為篩選拮抗細菌防治植物病害提供了很多的細菌資源。且細菌容易分離、繁殖較快，是生物防治的理想菌種。因此，本研究從貴州省天柱縣社學(xué)鄉(xiāng)等發(fā)青枯病的煙田土壤中篩選出對青枯病菌具有拮抗作用的細菌并進行鑒定。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株從貴州省麻江縣五寨鄉(xiāng)煙草種植區(qū)中選擇發(fā)煙草青枯病嚴重的田塊，從中采集病株帶回實驗室，采用平板劃線分離法進行分離、純化[7]。鑒定為煙草青枯病病原菌后，用蘸根接種法回接[8]，待發(fā)病后，再分離和純化病原菌，并采用滅菌蒸餾水保存方法保存?zhèn)溆肹9]。

1.1.2土壤樣品從貴州省天柱縣社學(xué)鄉(xiāng)、黃平縣白塘村及大方縣雙山鎮(zhèn)的煙草種植地中選擇發(fā)青枯病的煙田，從中采集健康煙株的根圍土壤，共12份。

1.1.3培養(yǎng)基及試劑

1.1.3.1分離和篩選培養(yǎng)基煙草青枯病病原菌和土壤細菌的分離以及對峙培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基均為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）。

1.1.3.2細菌鑒定培養(yǎng)基[10]馬鈴薯塊斜面培養(yǎng)基：將馬鈴薯洗凈去皮，切成長3.5～4.0 cm、寬0.5 cm的楔形薯塊斜面。為防止薯塊干燥，先在試管底部放1團吸飽水的棉花，再將薯塊粗的一端向下放入試管中，塞上棉塞，常規(guī)滅菌。為了中和細菌分解淀粉而產(chǎn)生過多的酸，可在滅菌前于薯塊斜面上加少量碳酸鈣。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏 3～5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～7.2。

1.1.3.3細菌鑒定染色劑革蘭氏染色劑和芽孢染色劑（孔雀綠染色劑）。

1.2方法

1.2.1病原菌分離選取煙草青枯病病株發(fā)病部位的一小塊組織（0.5 cm×0.5 cm）制成臨時裝片，用顯微鏡觀察細菌特有的噴菌現(xiàn)象，再選取被檢測發(fā)病部位周圍的組織，采用平板劃線分離法分離[7]。

1.2.2土壤采集選取種植年限較長且青枯病發(fā)生較重的煙田，在煙草旺長期采集健康煙株的根圍土壤（避免雨季采土）。取樣時先除去地面落葉和垃圾，撥開表土約 5 cm 深，剔除石礫和植被殘根等雜物，每份樣土約30 g（同地區(qū)取樣點至少相距100 m），裝入自封袋并做上記號，帶回實驗室。

1.2.3土壤細菌分離采用稀釋平板法[7]：用1/100天平準確稱取土樣10 g，放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中（瓶里放幾粒無菌玻璃珠），置于搖床振蕩20 min，使微生物細胞分散后，靜置20～30 s，即成10-1土樣稀釋液。用1 mL移液槍吸取10-1土樣稀釋液1 mL，移入裝有9 mL無菌水的試管中，混勻、稀釋，即成10-2稀釋液，再換1支無菌搶頭吸取10-2 稀釋液1 mL，移入另支裝有9 mL無菌水的試管中，再混勻、稀釋，即成10-3 稀釋液。依此類推，就會得到不同濃度的懸浮液，分離細菌所需稀釋倍數(shù)為103、104、105倍。

將培養(yǎng)基平板分別標上稀釋度及樣品編號，然后用移液槍吸取各樣品各稀釋度0.1 mL對號分散放于平板中，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。放置20 min后將平板倒置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。

1.2.4拮抗細菌篩選方法平板噴霧法[11]：將土壤細菌接在NA平板中央，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌體已在培養(yǎng)基上定殖后（約3 d），用無菌的喉頭噴霧器將濃度為 3億CFU/mL 的煙草青枯菌懸液噴入NA培養(yǎng)基上，靜置 20 min 后，將平板倒扣置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察并測量抑菌圈的直徑。以NA平板上不接菌只噴青枯菌作對照。初篩時做3個重復(fù)，挑選出效果較好的生防菌進行復(fù)篩，復(fù)篩時做5個重復(fù)。抑菌圈直徑的計算公式為：抑菌圈直徑=[（長直徑-生防菌直徑）+（短直徑-生防菌直徑）]/2；平均抑菌圈直徑=重復(fù)的抑菌圈直徑之和/重復(fù)的次數(shù)。

1.2.5拮抗細菌鑒定

1.2.5.116S rDNA序列分析采用CTAB法[12]提取細菌的總DNA，以DNA為模板，以細菌16S rDNA（由上海捷瑞生物工程有限公司合成）為通用引物[13] [正向PF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，對應(yīng)于大腸桿菌（Escherichia coli） 8～27 堿基；反向PR：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，對應(yīng)于大腸桿菌1 492～1 514堿基]，進行16S rDNA片段的擴增。

PCR的反應(yīng)體系（25.0 μL體系）：10×Buffer 2.5 μL、MgCl2 2.0 μL、dNTPs 2.0 μL、PF 1.2 μL、PR 1.2 μL、DNA模板 2.0 μL、Taq酶 0.25 μL、ddH2O 13.85 μL。

將PCR產(chǎn)物送于北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序，測序完成后，將得到的序列與網(wǎng)站（WWW.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中已知序列進行對比和同源性分析。

1.2.5.2細菌培養(yǎng)特征觀察觀察單菌落的形態(tài)、大小、表面特征以及透明度，斜面細菌菌苔的生長量、生長型以及菌苔與培養(yǎng)基顏色，細菌在NA培養(yǎng)液中生長的混濁狀態(tài)、沉淀情況以及有無結(jié)膜現(xiàn)象，細菌在馬鈴薯塊上生長情況、菌苔形態(tài)以及薯塊顏色變化情況。

1.2.5.3細菌革蘭氏染色和芽孢染色[14]革蘭氏染色：鏡檢時用油鏡觀察菌體，菌體呈藍紫色的為革蘭氏陽性菌（G+），成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。芽孢染色：將生有芽孢的細菌斜面菌苔按革蘭氏染色法涂片后，用飽和的孔雀綠水溶液染10 min，用清水沖洗；用番紅液復(fù)染30 s，水洗、吸干、鏡檢。被染后的芽孢呈紅色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

2結(jié)果與分析

2.1土壤拮抗細菌篩選結(jié)果

從12份土樣中共分離細菌65株，經(jīng)過初篩后，獲得20株具有拮抗作用的細菌，其中平均抑菌圈直徑小于20 mm的有18株，2株拮抗細菌的平均抑菌圈直徑大于20 mm。將這20株具有拮抗作用的細菌進行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)這20株拮抗細菌均表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑制效果，其中平均抑菌圈直徑大于20 mm的2株細菌復(fù)篩的平均抑菌圈直徑仍然大于20 mm，編號為C3-5、C5-3，其抑菌圈的平均直徑分別為39.98、48.88 mm。平板噴霧法對峙效果見圖1。

表124 h后2株細菌對煙草青枯菌的抑菌圈直徑及形態(tài)的影響

拮抗細菌

編號抑菌圈平均

直徑（mm）抑菌圈形態(tài)C3-539.98半透明、邊緣較清晰、界限明顯C5-348.88 半透明、邊緣較清晰、界限明顯CK0無

2.2土壤拮抗細菌鑒定結(jié)果

2.2.116S rDNA序列分析結(jié)果細菌C3-5的16S rDNA區(qū)域基因序列與芽孢桿菌屬（Bacillus）中蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）的同源性達99%。細菌C5-3的16S rDNA區(qū)域基因序列與球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）的同源性達99%。

2.2.2細菌培養(yǎng)特征及染色結(jié)果表2、表3、圖2、圖3顯示，C3-5的培養(yǎng)特征、染色結(jié)果、菌體的形狀等特征與蠟樣芽孢桿菌的相同，與該菌的16S rDNA序列分析結(jié)果一致，因此可鑒定C3-5為蠟樣芽孢桿菌。 C5-3的16S rDNA區(qū)域表22株細菌培養(yǎng)特征

編號NA上菌落特征斜面菌苔特征液體培養(yǎng)特征（2 d）薯塊生長特征（1 d）C3-5菌落大、圓形乳白色、生長良好、擴展狀、有絮狀沉淀生長良好、易擴散、不透明、粗糙、似蠟樣狀有小突起、乳白色

無結(jié)膜，無氣泡菌體乳白色、薯塊不變色C5-3菌落大、圓形乳白色、不透明、光滑、有同心圓生長中等、無擴展、乳白色

有絮狀沉淀有結(jié)膜、無氣泡

菌體白色、薯塊變褐色

表32株細菌染色特征

編號革蘭氏染色芽孢染色C3-5

陽性、桿狀、末端方，常成短或長鏈橢圓形或柱形、中生

C5-3

陽性、桿狀至梭狀

圓形或卵圓形、中生偏頂生，直徑大于菌體

基因序列結(jié)果顯示與球形賴氨酸芽孢桿菌的同源性高，根文獻[15-16]鑒定的結(jié)果一致，可以確定該菌屬于球形賴氨酸芽孢桿菌。

3結(jié)論與討論

經(jīng)平板對峙法篩選獲得的拮抗細菌占所分離出來的土壤細菌的比例為27.69%。其中，獲得了拮抗效果最好的拮抗

細菌2株，分別是蠟樣芽孢桿菌和球形賴氨酸芽孢桿菌，且分離于不同的地方。

廣泛認可芽孢桿菌屬中的多數(shù)細菌為良好的拮抗生防菌，如解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巴氏芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌和球狀芽孢桿菌都有降低植物病害發(fā)病率的作用[17]。余建等認為，許多細菌具有生防作用，其中包括芽孢桿菌屬，不僅能夠防治棉花黃萎病、水稻稻瘟病、煙草青枯病和油菜菌核病，還能促進煙株的生長[18]。易有金等發(fā)現(xiàn)，短短芽孢桿菌對煙草青枯病具有較強的拮抗作用，經(jīng)過室內(nèi)和田間試驗防效都較好[19]。這些結(jié)果與本研究相比，證明蠟樣芽孢桿菌是一株拮抗效果較好且較穩(wěn)定的生防菌。

本研究篩選出的另一株拮抗細菌為球形賴氨酸芽孢桿菌。目前，有研究報道可以利用該菌產(chǎn)生的生物錳氧化物吸附和回收金離子[16]以及該菌和嗜冷芽孢八疊球菌（Sporosarcina psychrophila）介導(dǎo)形成白云石晶體[20]，而該菌作為生防菌尚無報道。但是有關(guān)于球形芽孢桿菌（B. sphaericus）能作為生防菌的報道。劉波等報道，球形芽孢桿菌對青枯雷爾氏菌的強致病力菌株具有致弱作用[21]。周先治等發(fā)現(xiàn)球形芽孢桿菌的發(fā)酵上清液對青枯雷爾氏菌具有抑制作用[22]。由此可見，本研究篩選出效果最好的拮抗細菌，且作為與球形芽孢桿菌有關(guān)聯(lián)的細菌球形賴氨酸芽孢桿菌，在防治煙草青枯病上有很大的研究價值。

本研究同時也采用了平板噴霧法篩選拮抗放線菌，其抑菌圈形態(tài)比拮抗細菌抑菌圈的規(guī)整、透明度高，清晰明顯?？赡苁且驗榉啪€菌菌落表面干燥，生長不易受水分的影響，因此當噴青枯菌液在它上面時，不受培養(yǎng)基中水分影響而生長散亂。但是細菌卻不同，它喜歡在潮濕的環(huán)境下生長，隨著水分的流動而生長形成不規(guī)則的形態(tài)。因此，平板對峙效果也只能證明在室內(nèi)篩選的結(jié)果，要確定真正的生防效果還有待進一步進行田間試驗。

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本研究篩選出的另一株拮抗細菌為球形賴氨酸芽孢桿菌。目前，有研究報道可以利用該菌產(chǎn)生的生物錳氧化物吸附和回收金離子[16]以及該菌和嗜冷芽孢八疊球菌（Sporosarcina psychrophila）介導(dǎo)形成白云石晶體[20]，而該菌作為生防菌尚無報道。但是有關(guān)于球形芽孢桿菌（B. sphaericus）能作為生防菌的報道。劉波等報道，球形芽孢桿菌對青枯雷爾氏菌的強致病力菌株具有致弱作用[21]。周先治等發(fā)現(xiàn)球形芽孢桿菌的發(fā)酵上清液對青枯雷爾氏菌具有抑制作用[22]。由此可見，本研究篩選出效果最好的拮抗細菌，且作為與球形芽孢桿菌有關(guān)聯(lián)的細菌球形賴氨酸芽孢桿菌，在防治煙草青枯病上有很大的研究價值。

本研究同時也采用了平板噴霧法篩選拮抗放線菌，其抑菌圈形態(tài)比拮抗細菌抑菌圈的規(guī)整、透明度高，清晰明顯?？赡苁且驗榉啪€菌菌落表面干燥，生長不易受水分的影響，因此當噴青枯菌液在它上面時，不受培養(yǎng)基中水分影響而生長散亂。但是細菌卻不同，它喜歡在潮濕的環(huán)境下生長，隨著水分的流動而生長形成不規(guī)則的形態(tài)。因此，平板對峙效果也只能證明在室內(nèi)篩選的結(jié)果，要確定真正的生防效果還有待進一步進行田間試驗。

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