有機無機肥長期配施對毛竹林土壤固碳和固氮微生物的影響*

劉彩霞 陳俊輝 秦 華 梁辰飛 徐秋芳

(浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點實驗室 浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院 臨安 311300)

毛竹(Phyllostachysedulis)占中國竹林總面積的73%，種植面積達(dá)467.78萬hm2，也是整個森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分(國家林業(yè)和草原局, 2019)。近幾十年，農(nóng)民為了提高經(jīng)濟效益，傾向于使用見效快且施用方便的無機化肥，尤其是在耕作困難的山區(qū)和丘陵地帶(Liuetal., 2015)。已有研究證實，毛竹林長期以單施化肥為主的集約經(jīng)營方式易引起土壤侵蝕和養(yǎng)分淋失、土壤酸化、土壤碳氮儲量降低等土壤退化問題(Qinetal., 2017)，并導(dǎo)致土壤微生物生物量和多樣性降低，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)(Qinetal., 2017)。有機、無機肥配施可兼顧必需養(yǎng)分和有機碳供應(yīng)的雙重作用(公華銳等, 2019)，同時能增加土壤微生物生物量和酶活性(戚瑞敏等, 2019)，因此在毛竹林中推廣使用有機、無機肥配施對維持提高土壤肥力和保持土壤微生物區(qū)系健康具有重要意義。

土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)顯著影響土壤生態(tài)系統(tǒng)過程及其功能的發(fā)揮，特別是地球生物化學(xué)碳氮循環(huán)過程(沈菊培等, 2011)，其中土壤固碳和固氮微生物分別在地球生物化學(xué)碳氮循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用，且受土地管理措施的影響(Yuanetal., 2015； Fanetal., 2018)。固碳微生物通過吸收大氣中CO2并將其轉(zhuǎn)化為土壤有機碳來調(diào)節(jié)大氣中CO2濃度并提高土壤碳固定量(Wuetal., 2013)。每年通過土壤微生物固定的大氣中的CO2達(dá)0.6～4.9 Gt C，占陸地生態(tài)系統(tǒng)固定大氣CO2的0.5%～4.1%(Falkowskietal., 2000)。固氮微生物把大氣中的N2轉(zhuǎn)化為氨的過程稱之為生物固氮，每年通過微生物固氮方式輸入土壤的氮含量占全球大氣N2含量的16%(Ollivieretal., 2011)，對大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)的氮供應(yīng)起著重要作用，尤其是在低肥力土壤中(Normanetal.， 2016)。cbbL和nifH基因分別編碼核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)催化和固氮酶還原酶亞基基因，且具有高度保守性，已用于不同生態(tài)環(huán)境中固碳(Yuanetal., 2015)和固氮(楊璐等, 2020)微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究。目前，毛竹林長期有機、無機肥配施對固碳和固氮微生物的影響卻鮮見報道，本研究采集不同配施有機、無機肥年限的毛竹林地土壤，利用cbbL和nifH基因揭示有機、無機肥配施對固碳和固氮微生物豐度、群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，以期為我國竹林土壤肥力維持和提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省長興縣和平鎮(zhèn)(119°91′N，30°79′E)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，坡度20°～25°，向陽，年均氣溫15.6 ℃，降水量1 309 mm。土壤類型為粉砂巖形成的紅黏土，屬于鐵鋁土(WRB， 2006)。研究區(qū)之前杉木林，1999年改種毛竹并開始集約管理，經(jīng)營管理方式包括每年配施無機有機肥、清除林下植被和深耕，竹林密度為3 000株·hm-2，林下基本無灌木雜草，每年10月砍伐生長5年的新竹。未進(jìn)行集約管理的毛竹林地下植被以狗脊蕨(Woodwardiajaponica)和兔兒傘(Syneilesisaconitifolia)為主，蓋度為90%。每年6月施用有機肥(豬糞)5.25 t·hm-2，平均含有機質(zhì)119.6 g·kg-1，全氮5.6 g·kg-1，P2O58.3 g·kg-1，K2O 4.5 g·kg-1； 9月施用化肥，包括尿素(450 kg·hm-2)、過磷酸鈣(380 kg·hm-2)和氯化鉀(75 kg·hm-2)； 有機和無機肥料均采用溝施方式。

1.2 樣品采集與處理

2017年9月對研究區(qū)進(jìn)行嚴(yán)格實地調(diào)查評估，確認(rèn)毛竹林集約經(jīng)營的時間順序，最終確認(rèn)4個不同經(jīng)營年限毛竹林，分別是集約經(jīng)營(intensive management，IM)6年(IM6)、10年(IM10)、15年(IM15)和20年(IM20)，以立地條件相同且未施有機無機肥的毛竹林作為對照(CK)。為避免毛竹劇烈生長的春夏季以及施肥和間伐對土壤微生物的影響，因此選擇與以上時期有間隔的11月進(jìn)行采樣，每個年限林分建立3個20 m × 20 m 標(biāo)準(zhǔn)樣地(即3個重復(fù))，每個樣地小心去除凋落物層，采用5點取樣法采集表層(0～20 cm)和亞表層(20～40 cm)土壤，分別充分混勻過篩(2 mm)并裝入采樣袋，共30個樣品(2個土層 × 5個處理 × 3個重復(fù))。土壤樣品分為2份，1份放入-70 ℃冰箱，經(jīng)冷凍干燥后，進(jìn)行土壤DNA提?。?另1份于室內(nèi)自然風(fēng)干后，研磨過篩用于基本理化性質(zhì)分析。

1.3 土壤理化性質(zhì)分析

土壤化學(xué)性質(zhì)分析參照鮑士旦(2000)方法進(jìn)行。土壤pH值測定采用1∶2.5土水質(zhì)量比，用酸度計測定(Mettler Toledo Seveneasy，Sweden)； 有機碳含量(SOC)用重鉻酸鉀容量法； 全氮(TN)采用半微量凱氏定氮法； 堿解氮(AN)采用堿解擴散法； 土壤硝態(tài)氮(NO3--N)和銨態(tài)氮(NH4+-N)分別采用KCl浸提—紫外分光光度法和KCl浸提—靛酚藍(lán)比色法； 有效磷(AP)采用鹽酸-氟化銨溶液浸提—鉬銻抗比色法測定； 速效鉀(AK)采用醋酸銨提取—火焰光度計測定； 同位素比值質(zhì)譜儀(IsoPrime 100，Germany)和自動元素分析儀(vario MICRO cube，Germany)測定δ13C和δ13N的值。

1.4 土壤微生物總DNA的提取和熒光定量PCR

土壤總DNA提取、濃度和純度測定和保存方法參照文獻(xiàn)劉彩霞等(2018)進(jìn)行。采用實時熒光定量PCR(Real-time quantutative PCR，qPCR)分別測定固碳和固氮功能菌的cbbL和nifH基因拷貝數(shù)，cbbL基因特異性上游引物K2F (5’-AC CAYCAAGCCSAAGCTSGG-3’)，下游引物V2R(5’-GCCTTCSAGCTTGCCSACCRC-3’)(Yuanetal.， 2015)，nifH基因特異性上游引物PolF (5’-ATSGCATCATYTCRCCGGA-3’),下游引物PolR (5’-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3’)(Polyetal.， 2001)。cbbL和nifH基因進(jìn)行熒光定量PCR的擴增體系和反應(yīng)程序分別參照Yuan等(2015)和Xiao等(2020)。

1.5 cbbL和nifH基因末端限制性片段長度多態(tài)分析(T-RFLP)

采用末端限制性片段長度多態(tài)分析(terminal-restriction fragment length polymorph，T-RFLP)技術(shù)研究固碳和固氮功能菌群落，引物分別為K2F/V2R(Yuanetal., 2015) PolF/PolR(Polyetal., 2001)，上游引物5’端均用FAM熒光標(biāo)記。cbbL和nifH基因PCR產(chǎn)物純化后，分別利用限制性內(nèi)切酶MspI和HaeⅢ在37 ℃下消化4 h，酶切產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳(3730 Genetic Analyzer; Applied Biosystems, CA)自動測序分析。毛細(xì)管電泳圖譜分析和處理參照Yuan等(2015)。

1.6 cbbL和nifH基因克隆文庫

為了進(jìn)一步識別末端限制性片段(Terminal-restriction fragment，T-RF)，將不同處理的DNA樣品進(jìn)行等量混勻后作為PCR的模板來構(gòu)建cbbL和nifH基因克隆文庫?？寺∥膸鞓?gòu)建過程見劉彩霞等(2018)，本研究中產(chǎn)生的所有序列均已上傳到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，cbbL基因序列號MF430858～MF430936，nifH基因序列號MF6633454～MF663352。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 21.0進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析、單因素方差分析和雙因素方差分析，OriginPro 8.5進(jìn)行圖形繪制。BIO-DAP軟件計算微生物的香農(nóng)(Shannon)指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)和均勻度指數(shù)，采用R中的“vegan”包進(jìn)行相似性分析(ANOSIM)來確定不同集約經(jīng)營年限的固碳和固氮微生物組成的差異，采用Canoco 4.5軟件進(jìn)行微生物與土壤化學(xué)性質(zhì)之間的冗余分析(redundancy analysis，RDA)，其中均采用999次的蒙特卡洛置換檢驗顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹林土壤理化性質(zhì)變化

不同集約經(jīng)營年限毛竹林土壤樣品理化性質(zhì)結(jié)果見表1。土壤pH值穩(wěn)定在5.0～5.5，表層和亞表層土壤中SOC、TN、AN和AK含量在IM6和IM20顯著高于其他經(jīng)營年限和CK(P< 0.05)。表層土壤NH4+-N含量隨集約經(jīng)營時間延長而降低，且CK顯著高于IM6、IM15和IM20(P< 0.05)，亞表層NH4+-N變化規(guī)律與表層相反。除表層IM15外，表層和亞表層各經(jīng)營年限NO3--N含量高于CK。表層和亞表層土壤各經(jīng)營年限δ13C值均高于CK，IM15達(dá)到最高。表層土壤各經(jīng)營年限δ15N值顯著高于CK(P< 0.05)，亞表層土壤δ15N最大值出現(xiàn)在IM10。

表1 不同集約經(jīng)營年限毛竹林土壤理化性質(zhì)①Tab.1 Soil characteristics of long-term intensive managed Phyllostachys edulis stand

2.2 cbbL和nifH基因豐度及其與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

與對照相比，IM6、IM10和IM15表層土壤cbbL基因豐度顯著降低(P< 0.05)，IM20與CK無顯著差異； 表層和亞表層nifH基因豐度在集約經(jīng)營后顯著降低(P< 0.05)(圖1A和1B)。相關(guān)性結(jié)果表明，cbbL基因豐度與表層中AK呈顯著正相關(guān)，與AP呈顯著負(fù)相關(guān)； 與亞表層中AN和AK呈顯著正相關(guān)。表層土壤nifH基因豐度與NH4+-N呈顯著正相關(guān)，與亞表層C∶N呈顯著正相關(guān)，而與亞表層NH4+-N呈顯著負(fù)相關(guān)(圖1C)。

圖1 不同集約經(jīng)營年限毛竹林土壤固碳細(xì)菌cbbL和nifH基因豐度及其與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)Fig. 1 Abundance of cbbL and nifH gene under long-term intensive managed P. edulis stand and correlation coefficients of environment factors with the diversity indices of cbbL and nifH genes不同小寫字母代表表層(0～20 cm)不同經(jīng)營年限的顯著性差異(P < 0.05)，大寫字母代表亞表層(20～40 cm)不同經(jīng)營年限的顯著性差異(P < 0.05)。*P < 0.05，**P < 0.01,下同。Different lowercase and uppercase letters indicate significant differences among the stands in thechronosequence in topsoil and subsoil (P < 0.05), respectively. *P < 0.05;**P < 0.01.The same below.

2.3 毛竹林土壤固碳和固氮菌群落結(jié)構(gòu)及物種變化

cbbL基因擴增產(chǎn)物經(jīng)MspI酶切處理后得到17條 40～488 bp間的T-RFs。如圖2A所示，40 bp(9.7 %～24.1 %)和177 bp(22.1 %～54.4%)T-RFs是表層和亞表層所有施肥土壤的優(yōu)勢片段。44、168、175和360 bp則是某些經(jīng)營年限毛竹林土壤中的優(yōu)勢片段。表層土壤中44和360 bp相對豐度在IM6后急劇下降，亞表層土壤中360 bp的相對豐度在經(jīng)營10年后急劇下降，168 bp在經(jīng)營15年后出現(xiàn)在表土和亞表層土壤中。364 bp是表層土壤特有片段，439和488 bp是亞表層土壤特有片段。nifH基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)HaeⅢ 酶切處理后得到17條37～ 357 bp間的T-RFs(圖2B)，68、154、177、180 bp和332 bp是表層和亞表層中的優(yōu)勢片段，其中180 bp(22.1 %～54.4 %)是所有經(jīng)營年限土壤中的優(yōu)勢片段。表層和亞表層土壤中154和177 bp相對豐度在IM6、IM10和IM15高于CK和IM20，而68和332 bp的相對豐度規(guī)律則相反。以上結(jié)果表明，有機無機肥配施的集約經(jīng)營管理對這些片段代表的微生物產(chǎn)生影響。

圖2 不同集約經(jīng)營年限毛竹林土壤固碳細(xì)菌cbbL和nifH基因T-RFs相對豐度Fig. 2 Relative abundance of cbbL and nifH T-RFs under long-term intensive managed P. edulis forestsT-RF:末端限制性片段 Terminal restriction fragment.

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖3)表明，cbbL基因擴增產(chǎn)物的酶切片段177 bp與α-變形菌門中的慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)(CP013949.1)、紅螺菌(Rhodospirillumcentenum)(CP000613.2)、Starkeyanovella(CP002026.1)、Stappiameyerae(EF101506.1)以及γ-變形菌門中的運動硫黃球菌(Thioflavicoccusmobilis) (CP003051.1)6個物種的親緣關(guān)系較近，175 bp與Starkeyanovella(CP002026.1) 親緣關(guān)系較近，360 bp在CK和IM6土壤中豐度最高，與新加坡放線菌Actinopolymorphasingaporensis(LT629732.1)、菊苣中根瘤菌(M.cicero) (CP002447.1)和紅螺菌(R.centenum) (CP000613.2)親緣關(guān)系較近。表層土壤特有片段364 bp與(S.novella) (CP002026.1) 和慢性根瘤菌(CP013949.1)親緣關(guān)系較近，亞表層土壤特有片段439 bp與(S.meyerae)(EF101506.1)親緣關(guān)系較近(圖3A)。nifH基因擴增產(chǎn)物的酶切片段81、180、161和187 bp與Rhizobiumsp. (M16710.1)和Azorhizobiumdoebereinerae(FJ223129.1)親緣關(guān)系最近，47 bp與變異硫腐菌(Desulfovibriovulgaris) (CP002298.1)親緣關(guān)系最近(圖3B)。

圖3 cbbL和nifH序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on partial cbbL and nifH sequencesA： cbbL基因的系統(tǒng)發(fā)育分析; B： nifH基因的系統(tǒng)發(fā)育分析。HP： 和平(試驗地點)；HP后數(shù)字代表克隆子序號。GenBank登錄號后的數(shù)字表示cbbL和nifH用限制性內(nèi)切酶酶切后T-RFs大小。自舉值超過30%時在節(jié)點上顯示。 Phylogenetic analysis of the (A) partial cbbL sequence and (B) nifH gene affiliated with known sequences in GenBank. HP represent the experimental site of Heping and the numbers after HP represent the respective number of clones. The numbers after GenBank accession numbers indicate the respective sizes of the T-RFs after in silico analysis with the restriction enzyme Msp I for cbbL and Hae Ⅲ for nifH. The selective sequences from clone library were matched T-RFs found in the T-RFLP profiles as determined by endonuclease digestion. Bootstrap values are shown at nodes when they exceed 30% of replicates.

2.4 土壤固碳與固氮微生物群落結(jié)構(gòu)及其與土壤性質(zhì)的關(guān)系

ANOSIM分析結(jié)果表明，不同經(jīng)營年限間土壤固碳和固氮微生物群落存在顯著差異(P< 0.01)，為進(jìn)一步揭示集約經(jīng)營對固碳和固氮微生物群落的影響，利用cbbL和nifH基因T-RFLP片段信息和土壤化學(xué)性質(zhì)為2組變量進(jìn)行冗余分析(RDA)，結(jié)果表明，集約經(jīng)營措施顯著影響固碳和固氮微生物群落結(jié)構(gòu)，其中，固氮微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出經(jīng)過20年集約經(jīng)營后有恢復(fù)為經(jīng)營前群落結(jié)構(gòu)的趨勢。根據(jù)Canoco的forward分析，表層土壤的AP、δ13C和NH4+-N變化顯著影響固碳微生物群落結(jié)構(gòu)(圖4A)，亞表層土壤中δ13C變化顯著影響固碳微生物群落結(jié)構(gòu)(圖4B)。表層土壤中AK、SOC、C∶N和AN變化顯著影響土壤固氮微生物群落(圖4C)，亞表層中AP、NO3--N和C∶N變化顯著影響土壤固氮微生物群落(圖4D)。

圖4 毛竹林土壤固碳和固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis of CO2 fixating microbes and diazotroph community in soils of P. edulis standA： cbbL基因表層； B： cbbL基因亞表層； C: nifH基因表層； D: nifH基因亞表層。A and B were the topsoil and subsoil of cbbL gene, respectively; C and D were the topsoil and subsoil of nifH gene, respectively.

2.5 土壤固碳和固氮微生物群落多樣性及其與土壤性質(zhì)關(guān)系

根據(jù)T-RFLP圖譜中T-RFs分別計算表層和亞表層不同經(jīng)營年限土壤樣品的多樣性指數(shù)，包括Shannon指數(shù)、均勻度指數(shù)和Simpson指數(shù)，分別從微生物群落物種豐富度、物種均一性和常見物種3個方面反映微生物群落多樣性。結(jié)果表明，表層和亞表層土壤固碳和固氮微生物多樣性對有機無機肥配施反應(yīng)相似(表2)。毛竹林土壤表層和亞表層固碳微生物以及表層固氮微生物IM10處理的Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)均低于其他處理，而Simpson指數(shù)則相反，亞表層土壤中固氮微生物多樣性指數(shù)無顯著差異。雙因素方差分析表明，經(jīng)營時間顯著影響微生物多樣性(P< 0.05)。多樣性指數(shù)與土壤性質(zhì)的相關(guān)分析表明(圖5)，表層土壤固碳微生物的均勻度和亞表層的Shannon指數(shù)分別與土壤AK和AP含量呈正相關(guān)。而更多的土壤理化因子與固氮微生物多樣性指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)，包括表層土壤均勻度指數(shù)與SOC、TN和AN，亞表層土壤中NH4+-N均與Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)成正相關(guān)(P< 0.05)，而與Simpson指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(P< 0.05)。

表2 不同集約經(jīng)營年限毛竹林土壤固碳和固氮微生物多樣性①Tab.2 Microbial diversity of soil carbon and nitrogen fixation in P. edulis forest with different intensive management years

3 討論

3.1 有機無機肥配施對毛竹林土壤理化性質(zhì)的影響

長期大量施用化肥通常會降低土壤pH值，造成土壤酸化(Schroderetal., 2011)，但在本研究中毛竹林經(jīng)過20年的有機、無機肥配施，土壤pH值仍保持穩(wěn)定，說明這種施肥措施能夠避免竹林土壤酸化，另外與CK相比， 20年的有機、無機肥配施提高了土壤SOC、TN、AN和AP等養(yǎng)分的含量。本研究中SOC含量與未施肥相比，SOC經(jīng)營前6年急劇增加，經(jīng)營15年后降低， 20年后毛竹林SOC含量逐漸提高。SOC動態(tài)變化依賴于有機碳輸入和礦化的平衡(邢亞薇等, 2019)，前一階段的急劇增加可能是因為大量有機肥料投入但沒有迅速分解，隨著土壤微生物群落的改善，在隨后的經(jīng)營年限中SOC礦化加速，土壤有機碳下降到與對照相同的水平，說明毛竹林土壤有相對穩(wěn)定的有機碳循環(huán)動態(tài)，雖然每年輸入一定量豬糞有機肥，但有機質(zhì)礦物速率較大，不足以顯著提高SOC水平。土壤δ13C是研究植物群落歷史、確定土壤有機碳來源、指示土壤質(zhì)量和土壤碳固存率的重要指標(biāo)(Mendez-Millanetal., 2013; Zhangetal., 2015)，與土壤有機碳動態(tài)密切相關(guān)。本研究中，未經(jīng)營的毛竹林土壤δ13C值高于各經(jīng)營處理的δ13C值，且隨著經(jīng)營年限延長而提高。δ13C值的提高可能歸因于2個因素： 在酶促反應(yīng)中，含12C同位素的化學(xué)鍵比13C更容易被分解(Powersetal., 2002)，因此較輕的12C更容易通過有機物分解揮發(fā)，從而13C的占比增加(Guillaumeetal., 2015)。本研究中輸入的有機肥為豬糞，豬飼料中含有C4植物玉米(Zeamays)，C4植物δ13C的范圍為-17 ‰～-9 ‰高于C3植物(范圍為-32 ‰～-22 ‰)(Baietal., 2012)。

3.2 有機、無機肥配施對毛竹林土壤固碳和固氮微生物數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

毛竹林土壤中固碳和固氮微生物群落結(jié)構(gòu)對集約經(jīng)營響應(yīng)不同。隨著經(jīng)營時間的延長，CK與各經(jīng)營年限的土壤固碳微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著，而CK處理與經(jīng)營20年固氮微生物群落在RDA第一排序軸聚集在一起，說明經(jīng)過20年的經(jīng)營其結(jié)構(gòu)恢復(fù)到原來的狀態(tài)，表明土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定恢復(fù)能力。固碳微生物優(yōu)勢片段豐度在各經(jīng)營年限中不同，177 bp是表層和亞表層優(yōu)勢片段，它代表的菌群主要屬于變形菌門中的慢生根瘤菌、紅螺菌、中慢生根瘤菌S.novella、S.meyerae和T.mobilis。變形菌門是富營養(yǎng)菌群，適宜生長在養(yǎng)分充足的環(huán)境中(Fiereretal., 2007)，因此，177 bp代表的物種在CK中相對豐度較低，各經(jīng)營年限中由于大量有機和無機肥施入有利于其生長而提高其豐度。RDA分析結(jié)果表明，毛竹林表層土壤中AP和δ13C顯著影響固碳微生物群落結(jié)構(gòu)，表明集約經(jīng)營可能通過提高土壤AP含量而提高177 bp為代表的物種豐度，這一結(jié)果與Yuan等(2015)的結(jié)果相似，土壤P含量是調(diào)控含cbbL基因群落組成的主要因子之一。毛竹林土壤中優(yōu)勢固氮菌是根瘤菌和固氮根瘤菌，已經(jīng)證實根瘤菌廣泛存在于酸性土壤中(Fanetal., 2018)，因此根瘤菌能成為毛竹林土壤中的優(yōu)勢固氮菌。毛竹林土壤固碳和固氮微生物豐度對集約經(jīng)營反應(yīng)不同，與未施肥處理相比，本研究中以有機無機肥配施為主的經(jīng)營措施在經(jīng)營前15年降低土壤中固碳微生物豐度，經(jīng)營20年后固碳微生物豐度恢復(fù)到經(jīng)營前水平，而固氮微生物基于經(jīng)營后豐度持續(xù)下降。但與固碳和固氮微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)對集約經(jīng)營反應(yīng)不同相比，它們的多樣性表現(xiàn)出相似的規(guī)律。固碳和固氮微生物經(jīng)營10年后Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)顯著下降，這可能是因為肥料的施入刺激了某些適應(yīng)于寡營養(yǎng)環(huán)境的固碳和固氮微生物，但隨著施肥時間的延長肥效降低，集約經(jīng)營前期降低的適應(yīng)于寡營養(yǎng)環(huán)境的固碳和固氮微生物逐漸恢復(fù)而導(dǎo)致Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)在經(jīng)營后期(IM15和IM20)提高。在集約經(jīng)營前10年，表征優(yōu)勢物種豐富度的Simpson指數(shù)顯著增加，固碳菌優(yōu)勢片段177 bp和固氮菌優(yōu)勢片段180bp代表的優(yōu)勢種的增加可解釋這一結(jié)果。

圖5 環(huán)境因子與cbbL和nifH基因多樣性指數(shù)的相關(guān)系數(shù)①Fig. 5 Correlation coefficients of environment factors with the diversity indices of cbbL and nifH genes

3.3 毛竹林土壤理化性質(zhì)變化對土壤固碳和固氮微生物的影響

土壤pH值是影響土壤微生物的關(guān)鍵因子，而本研究中未發(fā)現(xiàn)固碳和固氮微生物豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)與土壤pH值的相關(guān)性。Zhou等(2019)認(rèn)為土壤pH值與新層土中固碳微生物群落結(jié)構(gòu)變化顯著相關(guān)，與本研究結(jié)果相反，這可能是因為長期(26年)不同配方無機施肥加劇了土壤酸化，未施肥處理與4種無機肥處理間的土壤pH值變化范圍為1～0.89，而本研究中有機肥的施用緩沖了無機肥施用引起的pH值降低(肖輝等， 2014)，CK處理與IM20土壤pH差值僅為0.26。另外，本研究毛竹林土壤中的固碳和固氮共同優(yōu)勢菌是根瘤菌，根瘤菌適宜生長的范圍是pH值4.5～5.5 (Fanetal., 2018)，本研究中不同處理間土壤pH值范圍是4.99～5.42。因此，較弱的pH變化和優(yōu)勢菌適應(yīng)生長的pH值范圍未發(fā)生改變是土壤固碳和固氮菌未響應(yīng)土壤pH值的變化的重要原因。土壤養(yǎng)分有效性是細(xì)菌豐度和多樣性的重要決定因素，已有研究表明cbbL基因豐度主要受SOC、AN和C:N等與土壤養(yǎng)分相關(guān)因子的影響(袁紅朝等， 2012)，在本研究中表層和亞表層土壤中cbbL基因豐度與AK含量變化顯著相關(guān)，隨著經(jīng)營年限延長有機、無機肥配施能顯著提高土壤AK含量，但其含量仍屬于極低水平(< 50)(鮑士旦等, 2000)，因此，毛竹林土壤中較低的AK含量導(dǎo)致土壤固碳微生物豐度的降低，說明AK含量是限制毛竹林土壤中固碳微生物生長的重要環(huán)境因子。本研究中有機、無機肥配施顯著降低了nifH基因豐度，這與Fan等(2019)的研究結(jié)果相似，即與無施肥處理相比，即使是有機材料(小麥秸稈、豬糞或牛糞)與化肥配施，土壤固氮微生物的固氮效率也下降了50%。nifH基因豐度與土壤中AN、NO3--N和NH4+-N含量變化顯著相關(guān)，Pereira等(2011)也證實固氮微生物對土壤中氮含量豐缺表現(xiàn)極其敏感。另外生物固氮是一個高耗能過程，而有機碳通常是其主要能量來源(Pfisteretal., 2010)，較高的土壤C:N使固氮微生物生長具有競爭優(yōu)勢，因此nifH基因豐度與亞表層土壤C:N呈正相關(guān)，同時C:N是驅(qū)動固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變化的重要因子(Wangetal., 2017)。綜上所述，土壤養(yǎng)分有效性是毛竹林土壤中固碳和固氮微生物豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化的重要原因。

4 結(jié)論

毛竹林有機、無機肥配施經(jīng)營20年后，土壤有機碳和速效氮、磷、鉀含量雖有波動，但總體為提高趨勢，土壤pH值一般穩(wěn)定在5.0～5.5，土壤未出現(xiàn)酸化現(xiàn)象。土壤固碳和固氮微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)對有機、無機肥配施措施響應(yīng)強烈，但規(guī)律不同。與未施肥對照相比，經(jīng)營15年后土壤固碳微生物豐度顯著降低，經(jīng)營20年后其豐度恢復(fù)到經(jīng)營前水平，而集約經(jīng)營后固氮微生物豐度保持下降趨勢。未施肥處理與毛竹林各經(jīng)營年限處理的固碳微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著，而經(jīng)營20年的固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與未施肥對照相似。毛竹林土壤有機無機肥配施20年后，固碳微生物豐度和固氮微生物群落結(jié)構(gòu)恢復(fù)到未施肥對照水平，說明長期采用有機、無機配施肥措施對毛竹林土壤固碳和固氮微生物顯著影響，也未造成土壤酸化，因此可在毛竹林經(jīng)營中推廣有機、無機配施，以緩解大量化肥施用對土壤造成的不良影響。