抵當(dāng)顆粒劑體外抗凝血與抗血栓作用的研究

梁珊珊，呂金南，張瑞光，孫小文，郭晶，侯慧，徐炳清，王秋紅，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

抵當(dāng)湯出自《傷寒論》，見于“太陽病，六七日表證仍在，脈微而沉，反不結(jié)胸，其人發(fā)狂者，以熱在下焦，少腹當(dāng)硬滿，小便自利者，下血乃愈。所以然者，以太陽隨經(jīng)，瘀熱在里故也，抵當(dāng)湯主之”。方劑組成為水蛭、虻蟲、桃仁、大黃，破血逐瘀之功效甚強(qiáng)，主治下焦瘀熱證［1］，癥狀為少腹急結(jié)或疼痛固定不移、或拒按、大便失常，其色如柏油，小便自利，發(fā)狂，或喜忘、或起臥不安、或身黃等?，F(xiàn)代臨床將抵當(dāng)湯進(jìn)行改良后應(yīng)用于腦血管病變，代謝綜合征，周圍血管癥，婦科疾病等，主要取活血化瘀的功效［2］。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，并參考《傷寒論》以抵當(dāng)湯為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代臨床用藥，制成抵當(dāng)顆粒劑，對(duì)其活血化瘀的各項(xiàng)功能指標(biāo)進(jìn)行研究。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

新西蘭大耳白兔，雄性，體質(zhì)量(2.5 ±0.2)Kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品與試劑

凝血酶、牛纖維蛋白原(北京索萊寶科技有限公司);生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè));枸櫞酸鈉(北京康普匯維科技有限公司);自制抵當(dāng)顆粒劑(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室自制)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫水浴鍋(武漢明思克化儀器有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱HH·B11·500(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);分析天平(BSA2245，德國賽多利斯集團(tuán))。

2 試驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥品的制備

用去離子水精確配制抵當(dāng)顆粒劑樣品的濃度，分別為 100.0、250.0、500.0、750.0μg/mL 和 1.0、2.0、3.0、4.0mg/mL，分別標(biāo)記為 A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，并于冰箱內(nèi)保存，供實(shí)驗(yàn)用。

2.2 體外抗凝血作用［3］

2.2.1 對(duì)家兔血漿復(fù)鈣時(shí)間的影響

家兔耳緣靜脈取血4.5mL，加至含有38g/L枸櫞酸鈉0.5mL的10mL離心管中，混勻，3000r/min離心10min，取上清液，4℃?zhèn)溆谩Ａ砣?6孔板1個(gè)，實(shí)驗(yàn)組每孔加入混合血漿0.1mL及不同質(zhì)量濃度的樣品溶液各0.1mL，對(duì)照組加入混合血漿0.1mL及生理鹽水0.1mL，于37℃溫育1min后分別向每孔加入2.775g/L CaCl2溶液0.1mL后開始計(jì)時(shí)，直到檢測到纖維蛋白絲時(shí)停止計(jì)時(shí)，重復(fù)10次，求平均值，即為血漿復(fù)鈣時(shí)間。

2.2.2 對(duì)凝血酶時(shí)間的影響

按“2.2.1”項(xiàng)的方法制備混合血漿，在96孔板中加入混合血漿和不同質(zhì)量濃度(同“2.2.1”項(xiàng))的樣品溶液各0.1mL，37℃溫育3min，再加入已預(yù)溫的1×104U/L凝血酶0.1mL，混勻，記錄血漿凝固所需的時(shí)間。以生理鹽水為對(duì)照組，每組重復(fù)10次，取平均值。

2.3 體外抗血栓作用［3］

2.3.1 溶栓作用

家兔頸總動(dòng)脈采血于試管中，按體積比為1∶9加入質(zhì)量濃度為38g/L枸櫞酸鈉溶液，然后依次加入纖維蛋白原溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%)、CaCl2溶液(55.5g/L)和凝血酶溶液(1.0×105U/L)，加入量為每毫升血中加入纖維蛋白原溶液20μL、CaCl2溶液10μL和凝血酶溶液20μL?；靹蚝?，注入到內(nèi)徑為8mm的玻璃試管中，37℃水浴20min后取出血栓，用濾紙吸干，切成5mm的小段，放入裝有不同質(zhì)量濃度(同“2.2.1”項(xiàng))的樣品溶液和生理鹽水2mL的試管中，37℃溫育，于 0、4、12、24、48h 內(nèi)分別測定剩余血栓段的質(zhì)量，計(jì)算血栓溶解率［4］，各藥物重復(fù)測定10次。

血栓溶解率(%)=(血栓初始質(zhì)量－藥物作用后各時(shí)間點(diǎn)血栓質(zhì)量)/血栓初始質(zhì)量×100%

2.3.2 對(duì)全血凝塊的溶解作用

家兔頸總動(dòng)脈采血20mL置于表面皿中，2h后自然凝固后切成0.3cm3的小塊，用生理鹽水淋洗3遍待用。將不同質(zhì)量濃度(同“2.2.1”項(xiàng))的樣品溶液和生理鹽水各2mL分別加入不同的安瓿瓶中，每組5小瓶，再向各瓶中隨機(jī)加入2個(gè)血塊，37℃水浴保溫，觀察血塊溶解情況，并分別于0、12、24、48h分別測定血塊的質(zhì)量，計(jì)算全血凝塊溶解率。

全血凝塊溶解率(%)=(血凝塊初始質(zhì)量－藥物作用后各時(shí)間點(diǎn)血凝塊質(zhì)量)/血凝塊初始質(zhì)量 ×100%

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 體外抗凝血作用

3.1.1 對(duì)家兔血漿復(fù)鈣時(shí)間的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，低劑量組無顯著性差異;隨著濃度的增大，抵當(dāng)顆粒組能延長家兔血漿復(fù)鈣時(shí)間，具有顯著性，且呈量效關(guān)系。

3.1.2 對(duì)凝血酶時(shí)間的影響

如表1所示，抵當(dāng)顆粒劑具有延長凝血酶時(shí)間的作用，隨濃度的增加作用越顯著，且呈量效關(guān)系。

表1 抵當(dāng)顆粒劑對(duì)家兔血漿復(fù)鈣時(shí)間及凝血酶時(shí)間的影響(s，n=10)

表1 抵當(dāng)顆粒劑對(duì)家兔血漿復(fù)鈣時(shí)間及凝血酶時(shí)間的影響(s，n=10)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05。

組別 濃度(mg/ml)血漿復(fù)鈣時(shí)間(s)凝血酶時(shí)間(s)對(duì)照組41.99 ±3.13 90.27 ±8.95 A 0.10 43.86 ±4.91 101.55 ±8.66 B 0.25 46.78 ±5.17 104.69 ±9.71 C－0.50 52.26 ±7.20＊＊ 110.45 ±12.10＊＊D 0.75 57.13 ±7.87* 117.28 ±13.79*E 1.00 63.06 ±8.32* 125.68 ±15.84*F 2.00 71.25 ±9.67* 138.64 ±15.34*G 3.00 76.43 ±11.43* 144.78 ±16.51*H 4.00 84.84 ±12.43* 150.89 ±20.93*

3.2 體外抗血栓作用

3.2.1 溶栓作用

如表2所示，隨著給藥時(shí)間的延長，各實(shí)驗(yàn)組的血栓溶解率也逐漸增大，血栓變得松散，漸漸呈顆粒狀。與對(duì)照組相比，濃度為 0.10、0.25mg/ml的低濃度組別無溶血栓作用外，其他各實(shí)驗(yàn)組均有顯著性的溶栓作用，并且，在供試量范圍內(nèi)樣品濃度為4.00mg/ml時(shí)達(dá)到最強(qiáng)溶栓作用。

3.2.2 對(duì)全血凝塊的溶解作用

與對(duì)照組相比，各樣品組在不同的時(shí)間點(diǎn)均顯示出較強(qiáng)的溶解全血凝塊的作用，并隨著給藥時(shí)間的延長，全血凝塊溶解率也依次增大，在供試品范圍內(nèi)，濃度為4.00mg/ml時(shí)，達(dá)到最大全血凝塊溶解率，見表3。

表2 抵當(dāng)顆粒劑對(duì)家兔體外血栓的溶解作用(s，n=10)

表2 抵當(dāng)顆粒劑對(duì)家兔體外血栓的溶解作用(s，n=10)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05。

4h 12h 24h 48h對(duì)照組 16.43 ±1.13 42.03 ±4.36 48.57 ±5.49 56.87 ±6.86組別 血栓溶解率(%)A 17.11 ±1.36 46.24 ±6.01 53.93 ±6.54 67.40 ±7.70 B 19.01 ±2.94 50.29 ±6.93 59.61 ±7.63＊＊ 71.14 ±8.48＊＊C 22.07 ±4.80 55.38 ±8.41* 63.54 ±9.43* 74.35 ±10.22*D 26.08 ±5.64＊＊ 59.05 ±8.30* 68.02 ±11.99* 79.44 ±12.55*E 33.71 ±8.95* 63.08 ±9.33* 72.37 ±10.22* 83.39 ±11.73*F 41.06 ±9.44* 68.33 ±7.51* 78.15 ±9.94* 86.41 ±10.90*G 47.86 ±9.55* 72.39 ±7.64* 82.24 ±8.43* 90.12 ±10.38*H 54.22 ±10.46*79.90 ±8.35* 84.64 ±7.56* 93.19 ±8.67*

表3 抵當(dāng)顆粒劑對(duì)家兔體外全血凝塊的溶解作用(s，n=5)

表3 抵當(dāng)顆粒劑對(duì)家兔體外全血凝塊的溶解作用(s，n=5)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05。

12h 24h 48h對(duì)照組組別 全血凝塊溶解率(%)18.28 ±2.33 26.66 ±5.83 39.73 ±6.93 A 28.59 ±5.57＊＊ 38.07 ±8.19＊＊ 51.44 ±8.00＊＊B 32.03 ±6.43* 45.33 ±8.79* 55.75 ±7.35*C 36.03 ±7.24* 49.71 ±8.32* 60.17 ±7.61*D 41.14 ±8.29* 53.36 ±7.73* 65.98 ±8.32*E 47.04 ±8.89* 58.21 ±7.48* 72.77 ±8.24*F 53.11 ±8.57* 63.41 ±9.34* 77.83 ±9.59*G 58.55 ±10.17* 69.35 ±10.31* 83.68 ±9.58*H 62.63 ±10.37* 77.60 ±11.42* 90.16 ±7.32*

4 討論

本文采用體外抗凝血與抗血栓實(shí)驗(yàn)，檢測抵當(dāng)顆粒劑對(duì)體外抗凝血及抗血栓的作用強(qiáng)度。在抗凝血實(shí)驗(yàn)中，低劑量組抗凝血效果不顯著，隨著劑量的增大，抗凝血效果逐漸明顯，與對(duì)照組比較具有顯著性差異;在溶栓作用實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，低劑量組無顯著性差異，隨著時(shí)間的延長，逐漸顯現(xiàn)出差異性;隨著劑量的增大，具有明顯的差異性，且隨著時(shí)間的延長，溶栓作用越強(qiáng);在全血凝塊的溶解作用實(shí)驗(yàn)中，抵當(dāng)顆粒劑各劑量組在不同的時(shí)間點(diǎn)均顯示出較強(qiáng)的溶解全血凝塊的作用，與對(duì)照組比較，具有顯著性差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接表明了抵當(dāng)顆粒劑在抗凝血與抗血栓方面具有較強(qiáng)的作用，這也間接的證明了抵當(dāng)顆粒劑在治療凝血或血栓引起的心腦血管疾病方面可能具有顯著的療效。其藥效學(xué)關(guān)系將在有關(guān)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］王付.經(jīng)方學(xué)用解讀［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2004:384.

［2］楊奇云，虞舜.抵當(dāng)湯臨床應(yīng)用近況［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12(5):31 －33.

［3］鐘山，崔征，王東，等.水蛭注射液抗血栓與抗凝血作用［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(7):456 －458.

［4］劉秀文，湯仲明，梁心平，等.重組葡激酶對(duì)兔實(shí)驗(yàn)性肺栓塞的溶栓作用［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998，33(11):801 －806.