樺褐孔菌與玉米須雙向固體發(fā)酵工藝優(yōu)化研究

曹思思，鄭宏宇，陳麗艷，方自若，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)系擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌綱，非褶菌目，銹革菌科，是一種非常稀缺的藥用真菌［1］，其含有的多糖、三萜類(lèi)化合物具有降糖、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、提高免疫等生物活性，具有很高的藥用開(kāi)發(fā)前景［2－4］。玉米須是禾本科玉蜀黍植物(Zea mays L.)的花柱和柱頭，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材［5］。玉米須中含有多糖、皂苷、黃酮、生物堿等，對(duì)嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的慢性代謝性疾病有較好的預(yù)防和治療作用［6］。樺褐孔菌生長(zhǎng)于高寒地區(qū)，自然資源匱乏，嚴(yán)重阻礙了其作為治療性藥物的開(kāi)發(fā)利用［7］。本研究采用雙向固體發(fā)酵的方法［8］，將樺褐孔菌與玉米須進(jìn)行雙向固體發(fā)酵得到樺須菌質(zhì)(HXJZ)，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物多糖和總?cè)频暮繙y(cè)定，確定該菌質(zhì)最佳培養(yǎng)工藝，為該藥用真菌的工業(yè)化生產(chǎn)及新藥源的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

樺褐孔菌(HLJ01，由黑龍江科學(xué)院微生物研究所惠贈(zèng));玉米須、玉米芯(哈爾濱東金現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司，批號(hào)1209016，產(chǎn)地黑龍江);VB1(沈陽(yáng)東藥克達(dá)制藥有限公司，批號(hào)2009024005);酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20100306);馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20110310);Sabourand培養(yǎng)基(上海亨代勞商貨有限公司);白樺脂醇對(duì)照品(成都瑞芬恩生物科技有限公司，含量≥98%，批號(hào) B－026－130116);KH2PO4、蔗糖、MgSO4、葡萄糖、香草醛、冰醋酸、高氯酸、蒽酚、濃硫酸等(國(guó)產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器

恒溫培養(yǎng)振蕩器(HNY－2102C，天津市歐諾儀器有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(GJ75，齊齊哈爾市醫(yī)療電子器械廠);超凈工作臺(tái)(SW－CJ－2D，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(HHT4－LX－C50L，上海申安醫(yī)療器械廠);恒溫水浴鍋(YH－8727A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);數(shù)控超聲波清洗器(KQ－500DA，昆山市超聲儀器有限公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV－160A，上海儀電分析儀器有限公司);聚丙烯高溫滅菌袋(亞速旺上海商貿(mào)有限公司)。

2 方法

2.1 液體菌種培養(yǎng) 將300g馬鈴薯切成2～5cm3見(jiàn)方小塊，加入蒸餾水煮沸30min，趁熱過(guò)濾，向?yàn)V液中加入玉米粉 5.0g，KH2PO43.0g，酵母膏 5.0g，蔗糖25g，MgSO41.5g，VB110mg，加蒸餾水至 1000ml，混合均勻分裝至5個(gè)三角瓶，加入直徑4mm玻璃珠6g/瓶，滅菌30min(121℃，0.1 ～0.15Mp)，放涼備用。用接種針刮取樺褐孔菌斜面菌絲體置于100ml無(wú)菌水中，渦旋，混合均勻，接種于上述液體培養(yǎng)基中，接種量2ml/瓶，置恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10天［120rmp/min，(26 ±2)℃］，待菌絲呈0.5 ～1cm 直徑球狀時(shí)，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱冷藏，保存，備用。

2.2 HXJZ的制備 取干燥的玉米須、玉米芯，依次以1:0、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 配比分組，共六組，分別記為A～F組，加3倍體積水悶潤(rùn)，每3h進(jìn)行混合翻動(dòng)，待水混合均勻后，將物料裝入聚丙烯高溫滅菌袋中，干重90g/袋，濕重 300g/袋，每組平行 3 袋，121℃，0.1 ～0.15Mp滅菌40min，放涼;取2.1項(xiàng)下制備的液體菌種進(jìn)行接種，每袋2ml，于(28±2)℃恒溫培養(yǎng)約50天。培養(yǎng)結(jié)束后，菌質(zhì)于70℃烘干，粉碎，待用。

2.3 平均生長(zhǎng)速率的測(cè)定 參照韓國(guó)國(guó)立農(nóng)業(yè)學(xué)院張玄酋教授等人的研究，每7天進(jìn)行2.2項(xiàng)下所制備的菌質(zhì)菌絲體生長(zhǎng)高度測(cè)量，并計(jì)算平均生長(zhǎng)速率。

2.4 總多糖、總?cè)坪繙y(cè)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.4.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱(chēng)取恒重葡萄糖20mg，置100ml容量瓶中，蒸餾水定容，即為葡萄糖母液。精密吸取上述母液 1、2、3、4、5ml于 10ml容量瓶，蒸餾水定容，得系列濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4.1.2 白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱(chēng)取白樺脂醇4.04mg，置25ml容量瓶中，無(wú)水乙醇定容，即為白樺脂醇母液。精密吸取上述母液 0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml，分別置于 10ml具塞試管中，得系列濃度的白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4.2 供試品的制備

2.4.2.1 HXJZ總多糖的制備 精密稱(chēng)取 HXJZ約2.0g，加水40ml，浸泡2h后，于恒溫水浴鍋100℃浸提2h，重復(fù)2次，濾過(guò)，合并濾液至100ml容量瓶中，定容，即得。

2.4.2.2 HXJZ總?cè)频闹苽?精密稱(chēng)取 HXJZ約2.0g，加入95%乙醇30ml，加熱回流提取2次，每次3h，濾過(guò)，合并濾液至100ml容量瓶中，用95%乙醇定容，即得。

2.4.3 線性關(guān)系的考察

2.4.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取2.4.1.1系列葡萄糖溶液1.0ml，置于10ml具塞試管中，以水為空白對(duì)照，采用蒽酮－硫酸法，在620nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為:Y=6.114X+0.125，r=0.9999(線性范圍2 ～10μg/ml)。

2.4.3.2 白樺脂醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取2.4.1.2系列白樺脂醇溶液，無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，采用香草醛－冰醋酸法，在551nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為:Y=0.0404X －0.0127，r=0.998(線性范圍 0 ～22.62μg/ml)。

2.4.4 方法學(xué)考察

由于本實(shí)驗(yàn)中總多糖、總?cè)坪繙y(cè)定方法較為成熟，故對(duì)其方法學(xué)的考察部分實(shí)驗(yàn)省略。

2.4.5 加權(quán)平均算法確定最佳培養(yǎng)基 采用定期測(cè)量菌絲體生長(zhǎng)高度來(lái)確定HXJZ平均生長(zhǎng)速率，同時(shí)以該菌質(zhì)總多糖、總?cè)坪繛橹笜?biāo)，運(yùn)用加權(quán)平均算法，確定HXJZ的最佳培養(yǎng)條件。

3 結(jié)果

3.1 不同配比固體培養(yǎng)基菌絲體平均生長(zhǎng)速率

本實(shí)驗(yàn)記錄樺褐孔菌在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵第25～50天生長(zhǎng)情況，發(fā)酵第40天各組均趨于平穩(wěn)生長(zhǎng)，由此得到菌絲體已完成生殖生長(zhǎng)，因此以發(fā)酵第40天，袋壁菌絲體生長(zhǎng)高度以8cm為基準(zhǔn)，設(shè)其平均生長(zhǎng)速率為1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。

表1 菌絲體平均生長(zhǎng)速率測(cè)定結(jié)果

圖1 不同配比固體培養(yǎng)基菌絲體平均生長(zhǎng)速率圖

3.2 HXJZ總多糖、總?cè)频暮繙y(cè)定

B～F組HXJZ總多糖、總?cè)坪坎捎米贤夥止夤舛确y(cè)得，結(jié)果見(jiàn)表2～3、圖2。

3.3 最佳固體培養(yǎng)基確定

在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，生產(chǎn)周期起著權(quán)重的作用。因此，菌絲體平均生長(zhǎng)速率占整個(gè)過(guò)程的40%，總多糖，總?cè)坪烤?0%作加權(quán)平均計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4。通過(guò)以菌絲體平均生長(zhǎng)速率、總多糖、總?cè)坪孔骷訖?quán)計(jì)算，最后確定樺褐孔菌與玉米須雙向固體發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度(28±2)℃，固體物料玉米須與玉米芯的最佳配比為1∶3，培養(yǎng)料干重90g/袋，液體菌種接種量為2ml/袋，靜置培養(yǎng)周期為50天。

表2 HXJZ總多糖含量測(cè)定結(jié)果

表3 HXJZ總?cè)坪繙y(cè)定結(jié)果

表4 加權(quán)平均數(shù)結(jié)果

4 討論

4.1 菌質(zhì)液體培養(yǎng)基的篩選

將樺褐孔菌分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯玉米面培養(yǎng)基(見(jiàn)2.1)，Sabourand培養(yǎng)基三種液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8～10天，參照莊毅等［8］研究實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)果表明，馬鈴薯玉米面培養(yǎng)基菌絲體干重高于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基0.4%、Sabourand培養(yǎng)基0.52%，且菌種活力最強(qiáng)，這可能與該菌體的生命代謝過(guò)程有關(guān)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇以馬鈴薯玉米面培養(yǎng)基為此菌種的液體培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樺褐孔菌在不同配方的培養(yǎng)基選擇上生長(zhǎng)具有很大的差異性，選擇適合的培養(yǎng)基進(jìn)行人工馴化，為其將來(lái)的工業(yè)化生產(chǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4.2 HXJZ的培養(yǎng)周期的確定

樺褐孔菌菌絲體從發(fā)酵第25天初期生長(zhǎng)階段到第40天進(jìn)入生長(zhǎng)速率的累進(jìn)期，通過(guò)對(duì)菌絲體的形態(tài)觀察，第40天已完成生殖生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿(mǎn)袋壁，第50天菌絲體干重達(dá)最大值，且已達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，比野生的生長(zhǎng)周期大大縮短。生長(zhǎng)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)A組培養(yǎng)基菌絲沒(méi)有生長(zhǎng)，D組菌絲體生長(zhǎng)速度較快，趨勢(shì)平穩(wěn)，生長(zhǎng)狀態(tài)較好，菌種活力較強(qiáng)。因此，選擇50天為其發(fā)酵周期。

4.3 HXJZ有效成分測(cè)定及培養(yǎng)條件研究

樺褐孔菌含有多種有效成分，臨床試驗(yàn)證實(shí)樺褐孔菌具有降血糖、降血壓、抗癌、抗衰老等作用，而玉米須在降血糖、利尿、利膽、循環(huán)系統(tǒng)方面有較好的治療作用［7］。本實(shí)驗(yàn)以不同配比玉米須、玉米芯作為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，接種樺褐孔菌進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，以生物活性成分多糖、三萜含量為考察指標(biāo)，確定其最佳培養(yǎng)條件。由圖2可知，HXJZ總多糖含量隨玉米須比例的減少而降低，但F組(玉米須:玉米芯為1∶5)總多糖含量又升高，而培養(yǎng)基全部為玉米須時(shí)，菌絲體不生長(zhǎng)，由此可見(jiàn)玉米須為樺褐孔菌提供功能性成分，玉米芯則作為營(yíng)養(yǎng)底物，這可能與樺褐孔菌生物學(xué)特性有關(guān)。三萜化合物主要通過(guò)一系列酶催化反應(yīng)形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物［9］，且各組培養(yǎng)基總?cè)坪肯嗖畈淮?，可?jiàn)總?cè)苹衔镛D(zhuǎn)化率較穩(wěn)定。利用該條件將樺褐孔菌與玉米須進(jìn)行雙向固體發(fā)酵培養(yǎng)可緩解野生子實(shí)體資源匱乏問(wèn)題，生產(chǎn)的多糖，三萜類(lèi)活性物質(zhì)合理可行，為樺褐孔菌產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了新途徑。

4.4 優(yōu)勢(shì)及前景

糖尿病占我國(guó)人群發(fā)病率1% ～5%，與癌癥、心腦血管疾病一起視為世界三大疾病，主要以2型糖尿病為主。目前，臨床上治療糖尿病以藥物治療為主，分為胰島素注射劑和口服降糖藥物。口服降糖藥物大部分為化學(xué)性藥物，副作用較明顯。而中藥在治療糖尿病方面卻有較好的優(yōu)勢(shì)［10－11］，因此，開(kāi)發(fā)中藥新藥是目前治療糖尿病最有效的途徑。鑒于樺褐孔菌與玉米須的應(yīng)用前景［6，12－13］，下一步將對(duì)樺褐孔菌與玉米須雙向固體發(fā)酵進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，在藥理學(xué)、藥效學(xué)和分子生物學(xué)方面有更加突破性進(jìn)展，開(kāi)發(fā)研制樺褐孔菌系列中醫(yī)藥保健食品。

［1］陳艷秋，李玉.樺褐孔菌的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2005，32(2):124－217.

［2］陳義勇，顧小紅，湯堅(jiān).樺褐孔菌多糖的抗腫瘤活性研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30(1):65 －69.

［3］李天洙，李香俊，金香子，等.樺褐孔菌影響糖尿病豚鼠糖代謝機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(8):1959 －1960.

［4］Mizuno T，Zhuang C，Abe K，et al.A ntiumor and hypo glycem ic activities of polysaccharides from the scleritia and mycelia of Inonotus obliquus［J］.Int J Med Mush rooms，1999，1(4):301 － 316.

［5］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥材標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥材標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1986:12.

［6］王英平，李向高.玉米須化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.特產(chǎn)研究，2004(2):42－46.

［7］黃年來(lái).俄羅斯神秘的民間藥用真菌——樺褐孔菌［J］.中國(guó)食用菌，2002，21(4):7 －8.

［8］莊毅.應(yīng)用藥用真菌新型固體發(fā)酵工程技術(shù)研制中藥一類(lèi)新藥的建立［J］.中藥新藥與臨床藥理，1995，6(4):41.

［9］林庚申，張小青，魏鐵錚，等.樺褐孔菌三萜類(lèi)物質(zhì)的提取與含量測(cè)定［J］.菌物學(xué)報(bào)，2007，26(3):396 －403.

［10］Li WL，Zheng HC，Bukuru J，et al.Natural medicines used in the traditional Chinese medical system for ther apy of diabetes mellitus［J］.J Ethnopharmacol，2004，92(1):1 －21.

［11］Yeh GY，Eisenberg DM，Kaptchuk TJ，et al.Systematic review of herbs and dietary supplements for glycemic control in diabetes［J］.Diabetes Care，2003，126(4):1277 －1294.

［12］Pegler DN.Useful fungi of the world:Amadou and chaga［J］.My cologist，2001，15(4):153 －154.

［13］景怡，景榮琴，任遠(yuǎn)，等.AB－8大孔吸附樹(shù)脂分離純化玉米須中總黃酮的研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(1):75 －78.