藍(lán)萼香茶菜二萜類物質(zhì)的提取工藝及其急毒實(shí)驗(yàn)的研究

張冰月，郎軼詠，王強(qiáng)

(1.北京大學(xué)香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 518000;2.解放軍第二0二醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110000)

藍(lán)萼甲素(glaucocalyxin A)是從唇科香茶菜屬植物香茶菜中提取分離出的一個(gè)二萜化合物。藍(lán)萼香茶菜是唇形科香茶菜屬植物［1］，生于山谷、林下、草叢中，分布于東北及河北、山西、山東等地。又名回菜花、香茶菜、山蘇子、野蘇子等，其全草或葉入藥能健胃消食，清熱解毒，活血［2］，主治脘腹脹痛，食滯納呆，脅痛，黃疸，感冒發(fā)熱，乳癰，蛇蟲咬傷等［3］。藍(lán)萼香茶菜在我國(guó)資源豐富，近幾年又發(fā)現(xiàn)新的二萜類、三萜類、黃酮及其他化學(xué)成分，其中有些成分現(xiàn)有研究已明確具有藥理活性［4］。二萜類化合物具有明顯的保護(hù)心肌細(xì)胞以及抗血小板聚集作用［5－7］。血小板具有黏附、聚集和釋放等功能，這與血小板具有止血和凝血作用有關(guān)。正常的血小板活化是體內(nèi)生理性止血的必需步驟，而病理性血小板活化與血栓性疾病相關(guān)。研究顯示，患有栓塞性心腦系統(tǒng)疾病(如冠心病、心絞痛、心肌梗死)的諸多患者，其體循環(huán)中的血小板對(duì)ADP、AA誘導(dǎo)的聚集性顯著增高［8－9］。因此，抑制血小板聚集的異常發(fā)生，對(duì)于血栓栓塞性心腦血管疾病的預(yù)防和治療具有積極的意義。本實(shí)驗(yàn)以冬凌草甲素為對(duì)照品，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同提取工藝提取的藍(lán)萼香茶菜總二萜的含量;采用RP－HPLC法測(cè)定不同提取工藝藍(lán)萼香茶菜中藍(lán)萼甲素含量;通過(guò)花生四烯酸(AA)和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集試驗(yàn)測(cè)定藍(lán)萼甲素對(duì)家兔體外血小板聚集的作用，考察藍(lán)萼香茶菜中總二萜類物質(zhì)抗凝血作用，為開發(fā)新型心腦血管藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和儀器

1.1 藥品

藍(lán)萼香茶菜(2010年9月采自撫順新賓地區(qū)，由沈陽(yáng)市解放軍202醫(yī)院制劑室制備);95%乙醇(批號(hào)20120114，沈陽(yáng)鑫金馳商貿(mào)責(zé)任有限公司);蒸餾水(解放軍202醫(yī)院制劑室提供);甲醇(批號(hào)20111208，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);丙酮(批號(hào)T20110110，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);活性炭粉狀(批號(hào)20100622，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);藍(lán)萼甲素(純度≥98%，HPLC，沈陽(yáng)市解放軍202醫(yī)院制劑室提供，動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)用DMSO助溶);蒸餾水(解放軍202醫(yī)院制劑室提供);花生四烯酸試劑及ADP試劑(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠，體質(zhì)量20g左右，雄性40只。由沈陽(yáng)市雙義動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(遼):2010－001。試驗(yàn)期間由解放軍二0二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供無(wú)菌固體飼料，自由飲水。

1.3 儀器

EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化株式會(huì)社);EYELA循環(huán)水式多用真空泵(日本東京理化株式會(huì)社);EYELA水浴鍋(日本東京理化株式會(huì)社);Lab Tech H35冷凝器(美國(guó)Lab Tech公司);FA2004型電子天平，(上海天平儀器廠);電子萬(wàn)用爐(北京市光明醫(yī)療儀器廠);電熱恒溫培養(yǎng)干燥兩用箱(廈門醫(yī)療電子儀器廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藍(lán)萼香茶菜總二萜提取

2.1.1 加熱回流法1

取藍(lán)萼香茶菜地上部分，精密稱取該植物干葉，搓碎后置于圓底燒瓶中，加8～10倍的95%乙醇沒(méi)過(guò)藥材，80℃加熱回流提取三次，提取時(shí)間分別為8h、6h、6h，過(guò)濾、合并濾液，減壓濃縮制得稠浸膏1。用甲醇溶解稠浸膏1并進(jìn)行過(guò)濾，濾液加1/100活性炭脫色，并對(duì)甲醇進(jìn)行回收，使之濃縮，形成稠浸膏2，再加丙酮溶解并進(jìn)行過(guò)濾，取濾液濃縮成稠浸膏3，如圖1a所示。將所得稠浸膏全部放入干燥箱內(nèi)干燥粉碎，備用。

2.1.2 加熱回流法2

初始過(guò)程如2.2.1法操作，得稠浸膏2后，將過(guò)濾過(guò)程中的濾渣加乙酸乙酯溶解，經(jīng)過(guò)濾紙過(guò)濾，回收乙酸乙酯，加熱濃縮成稠浸膏3;這一過(guò)程中會(huì)留下不溶的濾渣，對(duì)這些濾渣用甲醇進(jìn)行溶解，回收甲醇并濃縮，形成稠浸膏4;如圖1b所示，將所得稠浸膏全部放入干燥箱內(nèi)干燥粉碎，備用。

2.1.3 冷浸法

取藍(lán)萼香茶菜全草，精密稱取該植物干葉置密封的容器中，加入8～10倍量體積分?jǐn)?shù)95%乙醇冷浸。共浸泡7天，其間每隔半天攪拌1次，使有效成分溶解到溶液中，過(guò)濾，取濾液;藥渣壓榨，再將濾液與榨出液合并，靜置5日后濾出藥液;對(duì)藥渣進(jìn)行再次壓榨，并合并浸出液與榨出液，靜置3日后，對(duì)合并的液體再進(jìn)行過(guò)濾，對(duì)所得濾液進(jìn)行減壓濃縮，制得稠浸膏。用甲醇溶解稠浸膏并過(guò)濾，對(duì)濾液按1/100活性炭進(jìn)行脫色，回收甲醇使之濃縮成稠浸膏，再加丙酮使之溶解，濾過(guò)，取濾液濃縮成稠浸膏;過(guò)濾過(guò)程中的濾渣全部留下，加乙酸乙酯溶解，過(guò)濾，然后回收乙酸乙酯的同時(shí)使液體濃縮成稠浸膏;不溶的濾過(guò)的濾渣添加甲醇溶解為液體，繼續(xù)回收甲醇再使之濃縮成稠浸膏;將所得稠浸膏全部放入干燥箱內(nèi)干燥粉碎，備用。如圖1c。

2.2 藍(lán)萼香茶菜總二萜含量的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取冬凌草甲素標(biāo)準(zhǔn)品3mg，置10mL容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制及測(cè)定方法

分別精密稱取不同方法所制得的藍(lán)萼香茶菜提取物置10mL容量瓶中，加95%乙醇溶液并定容至刻度，再分別精密量取1mL于50mL容量瓶中，加95%乙醇溶液定容至刻度，即得不同方法制得的藍(lán)萼香茶菜提取物供試液。以95%乙醇為空白溶媒，于238nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算提取物中總二萜含量。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

化學(xué)研究表明，最具有活性成分的二萜和三萜成分均可以以在藍(lán)萼香茶菜莖葉部分中提取到，而二萜類最重要的成分是藍(lán)萼甲素，它的化學(xué)式相似于冬凌草甲素，故在使用紫外－分光光度法測(cè)定其有效物質(zhì)含量時(shí)，可以冬凌草甲素為標(biāo)準(zhǔn)品，其最大吸收波長(zhǎng)在238nm 處。分別精密量取對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5mL 于 10mL 容量瓶中，以 95%乙醇稀釋至刻度，得系列濃度的溶液。以95%乙醇為空白溶媒，在238nm波長(zhǎng)下測(cè)定各系列濃度對(duì)照品的吸光度A，根據(jù)吸光度A繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 藍(lán)萼香茶菜總二萜提取流程圖

2.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

取18～22g健康小鼠40只，隨機(jī)分為4組，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前12h禁食不禁水。根據(jù)藍(lán)萼香茶菜灌胃給藥(藥液濃度最高為0.01g/ml)。根據(jù)預(yù)試結(jié)果，確定一次灌胃給藥最高劑量為0.002g/kg，最低劑量為0.00025g/kg，劑量比 1∶0.5。灌胃容積 0.2ml/10g，給藥后，記錄動(dòng)物死亡及反應(yīng)情況，連續(xù)觀察7天。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行用SPSS曲線估計(jì)模型擬合，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以橫坐標(biāo)為濃度(C)，縱坐標(biāo)為吸光度(A)，如圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)圖2)表明該標(biāo)準(zhǔn)品在3～45mg/L濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為 A=0.0275C－0.0106(R2=0.9994)。

圖2 吸光度A與濃度C的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 提取工藝對(duì)藍(lán)萼香茶菜干燥品中總二萜含量的影響

結(jié)合稀釋濃度、干燥品總二萜重量、所用的生藥重量，計(jì)算得出藍(lán)萼香茶菜干燥品中被95%乙醇所提取的二萜類物質(zhì)百分含量以及每克原藥材重所含總二萜含量，結(jié)果如表1。

表1 不同提取工藝制得藍(lán)萼香茶菜干燥品中有效成份含量的分析

3.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用簡(jiǎn)化機(jī)率法計(jì)算LD50及LD50的95%平均可信區(qū)間。結(jié)果表明，LD50=1.090mg/kg，LD50的95%平均可信限 L95=0.001490 ～0.0007978(見(jiàn)表2)。

表2 藍(lán)萼香茶菜對(duì)小鼠灌胃給藥LD50實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=10)

4 討論

最佳的提取工藝對(duì)藥物的分子量、溶解度、化學(xué)穩(wěn)定性、提取量等都有一定的影響，本實(shí)驗(yàn)最開始對(duì)三種最佳提取工藝進(jìn)行了研究?？紤]到各溶劑的提取效率、毒性、成本、提取量等因素，在藍(lán)萼香茶菜急性毒實(shí)驗(yàn)的提取工藝中，使用95%乙醇為溶劑。

三種方法提取藍(lán)萼香茶菜莖葉部分生藥中總二萜含量最高的是第二種，第一種其次，但是綜合考慮各方法的提取效率、毒性、成本、灌胃性狀等因素，建議在藍(lán)萼香茶菜動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用第一種方法提出的藍(lán)萼香茶菜總二萜。

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