通竅益心丸促血管生成作用的實驗研究

傅曉東++林錦培++陳偉華

【摘要】目的：建立雞胚絨毛尿囊膜（CAM）模型并探討中藥通竅益心丸干預(yù)對血管生成作用的影響。方法：本實驗采用血清藥理學(xué)的方法制備藥物血清并建立雞胚絨毛尿囊膜（CAM）模型，雞胚隨機(jī)分為空白血清組、VEGF組及通竅益心丸大、小劑量組，干預(yù)后檢測雞胚絨毛尿囊膜的血管增生程度。結(jié)果：通竅益心丸小劑量組CAM的血管增生數(shù)與空白血清組相比有明顯差異（P<0.05），而通心絡(luò)大劑量組的血管增生數(shù)不僅與空白組有顯著差異（P<0.01），且與VEGF組無明顯差異（P>0.05）。結(jié)論：通竅益心丸能夠促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜的血管增生，并呈劑量依賴性，具有一定的促血管新生作用。

【關(guān)鍵詞】血管生成；雞胚絨毛尿囊膜；通竅益心丸

[Abstract]Objective：The stimulate angiogenesis effect of TongQiaoYiXin Tablet on the chick embryo chorioallantoic membrane（CAM）model were studied.Methods：38 chick embryo（CE）were randomly divided into 4 groups，9 CE in group A were treated with vacuity blood serum as negative controls，10 CE in group D were treated with VEGF（vascular endothelial growth factor）as positive controls，9 CE in group B and 10 CE in group D were treated with micro-dose and maxims of TongQiaoYiXin herbal serum respectively.After 3 days of incubated，counting the first and second grade vessels and angiogenesis area.Results：the proliferation of vessels and angiogenesis area group B was obviously increase than group A（P<0.05）and group C was obviously increase than group A（P<0.01），but group C has no obviously difference controlled with group D（P>0.05）.Conclusions：TongQiaoYiXin Tablet could stimulate angiogenesis of the CAM model and showed good protective on myocardial ischemia.

[Key Words]angiogenes；chorioallantoic membrane（CAM）；TongQiaoYiXin Tablet

血管新生（angiogenesis）是指在原有的毛細(xì)血管和/或微靜脈基礎(chǔ)上通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，從已存在的血管處以芽生或非芽生（套迭）形成新的，以毛細(xì)血管為主的血管系統(tǒng)過程[1]。冠心病現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為是一種由于冠狀動脈狹窄或閉塞導(dǎo)致心肌缺血，進(jìn)而影響心功能的臨床常見的心血管疾病，介入治療對部分患者有應(yīng)用限制且療效仍有待提高[2]。而冠脈側(cè)枝血管的形成和開放能部分緩解心肌的缺血，改善患者的臨床癥狀與預(yù)后，近年來研究主要集中在藥物治療，尤其是中藥干預(yù)以加強(qiáng)新生側(cè)枝血管的自然過程從而維持冠狀動脈漸進(jìn)性閉塞時的血流量，即治療性血管增生以減輕心肌缺血逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)[3]，因此本實驗擬通過雞胚絨毛尿囊膜（CAM）模型探討中藥通竅益心丸干預(yù)對血管生成作用的影響。

CAM模型建立：參照付生法等研究方法改良[5]。選取發(fā)育良好的白皮種蛋，用溫水清洗2次并消毒后放入37℃孵化箱，氣室向上，每天轉(zhuǎn)動3～4次，孵蛋直至第9天后取出，首先將種蛋表面進(jìn)行消毒，而后在超凈工作臺中將氣室頂端打一個約1～2mm的小孔，并在距胎頭前1cm處、兩條前卵黃靜脈之間的卵殼投影部位，75%酒精消毒后沿著長方形區(qū)域的邊線磨切透卵殼，切勿損傷下方的卵殼膜，繼而在卵殼膜上輕輕劃開一個直徑約1mm的小孔，滴加無菌蒸餾水少許，讓液體浸入卵殼膜與CAM之間，使得雞胚的尿囊絨毛膜與雞蛋的卵殼膜分離，選擇無菌微孔濾膜載體，用打孔器制成直徑5mm的圓片。并將其放在CAM的血管最為稀少的地方，同時在載體中央滴加之前配置好的各組相對應(yīng)的血清（滴加的液體量為10μl/每蛋）。加藥后使用無菌透明膠封窗并做好標(biāo)記，放入37.8℃的孵箱內(nèi)持續(xù)孵育3天。3天后每個種蛋注入混合固定液2.5ml（甲醇、丙酮1：1等量混合），置于室溫下固定20分鐘，待CAM的血管內(nèi)血液完全凝固后，用眼科鑷揭去封窗的透明膜，同時剪除CAM水平以上的蛋殼，以濾膜載體為中心把CAM剪下，置入盛有少量蒸餾水并鋪有濾紙的平皿里展開，陰干后連同濾紙保存。采用解剖顯微鏡觀察，凡屬趨向性生長的血管，即以載體為中心發(fā)出，與濾膜半徑的夾角小于45度者均予計數(shù)，而穿行、繞行的血管則不算在內(nèi)。實驗部位邊緣（即微孔濾膜載體邊緣）1mm范圍內(nèi)為一級血管，實驗部位邊緣5mm處為二級血管，一、二級血管以相同放大倍數(shù)分別觀察計數(shù)。

討論

治療性血管新生于2000年在美國心血管年會上提出，是指利用血管新生促進(jìn)因子刺激局部血管新生，形成有效的側(cè)支循環(huán)，有助于改善動脈粥樣硬化時心臟與外周動脈狹窄導(dǎo)致局部供血不足。已知的促血管新生因子有成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、血管生長素1（angiogenin-1，ANG-1）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等[7]，由于目前研究采用促血管新生因子治療冠心病仍處于臨床實驗階段，尚有諸多問題需要解決，諸如給藥途徑、起效時間及安全性等。

多項研究發(fā)現(xiàn)部分中藥單體具有影響血管新生的作用[8]，但與臨床普遍采用中藥復(fù)方治療的情況脫節(jié)。而中藥復(fù)方的研究則更為復(fù)雜和困難，因為其是多種藥物的有機(jī)組合，體現(xiàn)的是經(jīng)生物體自身消化和吸收所形成的綜合作用，即進(jìn)入體內(nèi)后所發(fā)生的一系列代謝變化，因此中藥復(fù)方藥理的體外研究往往和體內(nèi)實驗存在一定的差距，因此我們采用血清藥理學(xué)的方法以求能夠模擬中藥經(jīng)體內(nèi)代謝后的作用[9]，使實驗結(jié)果能夠最大限度與臨床相仿。

血管新生的體外模型目前比較公認(rèn)的是雞胚尿囊膜（CAM），因其方法較簡便，計數(shù)指標(biāo)在實驗研究中客觀成熟并具有良好的重復(fù)性，能夠定性、定量檢測不同成份及生物因子等對血管的促進(jìn)或抑制作用，在應(yīng)用CAM進(jìn)行定量分析時，以往多采用計數(shù)給藥周圍血管數(shù)的方法，由于存在對新生血管定義不清，人工計數(shù)可重復(fù)性較差等問題，我們在采用計數(shù)的同時，運(yùn)用Image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行血管新生面積的測算，由于其可只對特定區(qū)域內(nèi)的血管進(jìn)行統(tǒng)計，具有精確、客觀、可重復(fù)記算等優(yōu)點(diǎn)，通過兩種方法互相配合可以更客觀地反映實驗結(jié)果。

通竅益心丸是國家保護(hù)品種，由麝香、牛黃、蟾酥、珍珠、冰片、三七等組成，多年臨床應(yīng)用證明其具有活血化瘀，益氣強(qiáng)心，通竅止痛等作用，其組成藥物中有多味已被證實具有促進(jìn)血管新生的作用；本實驗研究提示中藥復(fù)方通竅益心丸能夠促進(jìn)血管生成，呈劑量依賴性，大劑量組療效與VEGF相仿，表明通竅益心丸可能通過促進(jìn)血管生成，從而達(dá)到改善供血不足導(dǎo)致的疾病，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。進(jìn)一步的工作希望能通過心肌缺血動物模型及臨床循證醫(yī)學(xué)研究以明確其對冠心病患者能促進(jìn)血管新生，有效建立側(cè)枝循環(huán)的療效。（本工作得到上海舜百生物工程公司的大力協(xié)助，特此致謝?。?/p>

參考文獻(xiàn)

[1]Jiang C，Lu H，Vincent KA，et al.Gene expression profiles in human cardiac cells subjected to hypoxia or expressing a hy-brid form of HII-1 alpha[J].Physiol Genomics，2002，8（1）：23-32.

[2]Ross R.Cell biology and atherosclerosis[J].Ann Rev Physiol，1995，（57）：791-804.

[3]王培利，雷燕，陳可冀.血管新生-治療心血管疾病的新策略[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（2）173-176.

[4]劉平，周建鋒，胡義揚(yáng)，等.益氣養(yǎng)陰誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞分化作用與意義[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6（8）：29-34.

[5]付生法，陸應(yīng)麟，張朝山，等.檢測血管生長因子作用的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1993，（17）：294-296.

[6]李玉娟，段昌令，李鴻海，等.丹酚酸B對雞胚絨毛尿囊膜血管新生作用的影響[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27（11）：905-907.

[7]范維琥.麝香保心丸治療性血管新生的臨床研究[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2006，22（4）：46.

[8]陳文元，吳立婭，陳巖，等.中藥影響血管新生作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（3）：237-239.

[9]Sakae Amagya，Kazumichi，Akira Miyake，et al.A new pharmacological testing method-Different effects of levamisole and the serum of mice orally treated with levamisole on mitogenic activity of lipopolysaccharide[J].J Chem Pharm Bull，1989，37（4）：1117-1119.

多項研究發(fā)現(xiàn)部分中藥單體具有影響血管新生的作用[8]，但與臨床普遍采用中藥復(fù)方治療的情況脫節(jié)。而中藥復(fù)方的研究則更為復(fù)雜和困難，因為其是多種藥物的有機(jī)組合，體現(xiàn)的是經(jīng)生物體自身消化和吸收所形成的綜合作用，即進(jìn)入體內(nèi)后所發(fā)生的一系列代謝變化，因此中藥復(fù)方藥理的體外研究往往和體內(nèi)實驗存在一定的差距，因此我們采用血清藥理學(xué)的方法以求能夠模擬中藥經(jīng)體內(nèi)代謝后的作用[9]，使實驗結(jié)果能夠最大限度與臨床相仿。

血管新生的體外模型目前比較公認(rèn)的是雞胚尿囊膜（CAM），因其方法較簡便，計數(shù)指標(biāo)在實驗研究中客觀成熟并具有良好的重復(fù)性，能夠定性、定量檢測不同成份及生物因子等對血管的促進(jìn)或抑制作用，在應(yīng)用CAM進(jìn)行定量分析時，以往多采用計數(shù)給藥周圍血管數(shù)的方法，由于存在對新生血管定義不清，人工計數(shù)可重復(fù)性較差等問題，我們在采用計數(shù)的同時，運(yùn)用Image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行血管新生面積的測算，由于其可只對特定區(qū)域內(nèi)的血管進(jìn)行統(tǒng)計，具有精確、客觀、可重復(fù)記算等優(yōu)點(diǎn)，通過兩種方法互相配合可以更客觀地反映實驗結(jié)果。

通竅益心丸是國家保護(hù)品種，由麝香、牛黃、蟾酥、珍珠、冰片、三七等組成，多年臨床應(yīng)用證明其具有活血化瘀，益氣強(qiáng)心，通竅止痛等作用，其組成藥物中有多味已被證實具有促進(jìn)血管新生的作用；本實驗研究提示中藥復(fù)方通竅益心丸能夠促進(jìn)血管生成，呈劑量依賴性，大劑量組療效與VEGF相仿，表明通竅益心丸可能通過促進(jìn)血管生成，從而達(dá)到改善供血不足導(dǎo)致的疾病，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。進(jìn)一步的工作希望能通過心肌缺血動物模型及臨床循證醫(yī)學(xué)研究以明確其對冠心病患者能促進(jìn)血管新生，有效建立側(cè)枝循環(huán)的療效。（本工作得到上海舜百生物工程公司的大力協(xié)助，特此致謝?。?/p>

參考文獻(xiàn)

[1]Jiang C，Lu H，Vincent KA，et al.Gene expression profiles in human cardiac cells subjected to hypoxia or expressing a hy-brid form of HII-1 alpha[J].Physiol Genomics，2002，8（1）：23-32.

[2]Ross R.Cell biology and atherosclerosis[J].Ann Rev Physiol，1995，（57）：791-804.

[3]王培利，雷燕，陳可冀.血管新生-治療心血管疾病的新策略[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（2）173-176.

[4]劉平，周建鋒，胡義揚(yáng)，等.益氣養(yǎng)陰誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞分化作用與意義[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6（8）：29-34.

[5]付生法，陸應(yīng)麟，張朝山，等.檢測血管生長因子作用的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1993，（17）：294-296.

[6]李玉娟，段昌令，李鴻海，等.丹酚酸B對雞胚絨毛尿囊膜血管新生作用的影響[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27（11）：905-907.

[7]范維琥.麝香保心丸治療性血管新生的臨床研究[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2006，22（4）：46.

[8]陳文元，吳立婭，陳巖，等.中藥影響血管新生作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（3）：237-239.

[9]Sakae Amagya，Kazumichi，Akira Miyake，et al.A new pharmacological testing method-Different effects of levamisole and the serum of mice orally treated with levamisole on mitogenic activity of lipopolysaccharide[J].J Chem Pharm Bull，1989，37（4）：1117-1119.

多項研究發(fā)現(xiàn)部分中藥單體具有影響血管新生的作用[8]，但與臨床普遍采用中藥復(fù)方治療的情況脫節(jié)。而中藥復(fù)方的研究則更為復(fù)雜和困難，因為其是多種藥物的有機(jī)組合，體現(xiàn)的是經(jīng)生物體自身消化和吸收所形成的綜合作用，即進(jìn)入體內(nèi)后所發(fā)生的一系列代謝變化，因此中藥復(fù)方藥理的體外研究往往和體內(nèi)實驗存在一定的差距，因此我們采用血清藥理學(xué)的方法以求能夠模擬中藥經(jīng)體內(nèi)代謝后的作用[9]，使實驗結(jié)果能夠最大限度與臨床相仿。

血管新生的體外模型目前比較公認(rèn)的是雞胚尿囊膜（CAM），因其方法較簡便，計數(shù)指標(biāo)在實驗研究中客觀成熟并具有良好的重復(fù)性，能夠定性、定量檢測不同成份及生物因子等對血管的促進(jìn)或抑制作用，在應(yīng)用CAM進(jìn)行定量分析時，以往多采用計數(shù)給藥周圍血管數(shù)的方法，由于存在對新生血管定義不清，人工計數(shù)可重復(fù)性較差等問題，我們在采用計數(shù)的同時，運(yùn)用Image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行血管新生面積的測算，由于其可只對特定區(qū)域內(nèi)的血管進(jìn)行統(tǒng)計，具有精確、客觀、可重復(fù)記算等優(yōu)點(diǎn)，通過兩種方法互相配合可以更客觀地反映實驗結(jié)果。

通竅益心丸是國家保護(hù)品種，由麝香、牛黃、蟾酥、珍珠、冰片、三七等組成，多年臨床應(yīng)用證明其具有活血化瘀，益氣強(qiáng)心，通竅止痛等作用，其組成藥物中有多味已被證實具有促進(jìn)血管新生的作用；本實驗研究提示中藥復(fù)方通竅益心丸能夠促進(jìn)血管生成，呈劑量依賴性，大劑量組療效與VEGF相仿，表明通竅益心丸可能通過促進(jìn)血管生成，從而達(dá)到改善供血不足導(dǎo)致的疾病，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。進(jìn)一步的工作希望能通過心肌缺血動物模型及臨床循證醫(yī)學(xué)研究以明確其對冠心病患者能促進(jìn)血管新生，有效建立側(cè)枝循環(huán)的療效。（本工作得到上海舜百生物工程公司的大力協(xié)助，特此致謝?。?/p>

參考文獻(xiàn)

[1]Jiang C，Lu H，Vincent KA，et al.Gene expression profiles in human cardiac cells subjected to hypoxia or expressing a hy-brid form of HII-1 alpha[J].Physiol Genomics，2002，8（1）：23-32.

[2]Ross R.Cell biology and atherosclerosis[J].Ann Rev Physiol，1995，（57）：791-804.

[3]王培利，雷燕，陳可冀.血管新生-治療心血管疾病的新策略[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（2）173-176.

[4]劉平，周建鋒，胡義揚(yáng)，等.益氣養(yǎng)陰誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞分化作用與意義[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6（8）：29-34.

[5]付生法，陸應(yīng)麟，張朝山，等.檢測血管生長因子作用的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1993，（17）：294-296.

[6]李玉娟，段昌令，李鴻海，等.丹酚酸B對雞胚絨毛尿囊膜血管新生作用的影響[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27（11）：905-907.

[7]范維琥.麝香保心丸治療性血管新生的臨床研究[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2006，22（4）：46.

[8]陳文元，吳立婭，陳巖，等.中藥影響血管新生作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（3）：237-239.

[9]Sakae Amagya，Kazumichi，Akira Miyake，et al.A new pharmacological testing method-Different effects of levamisole and the serum of mice orally treated with levamisole on mitogenic activity of lipopolysaccharide[J].J Chem Pharm Bull，1989，37（4）：1117-1119.