反復(fù)腹腔注射脂多糖誘導(dǎo)大鼠阿爾茨海默病樣神經(jīng)炎癥

李明剛，鄧媛媛，石京山，龔其海

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)為臨床常見病、多發(fā)病，占老年癡呆發(fā)病的60%～70%。AD的主要病理特征為老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)元變性、缺失[1]。AD病因及發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全明了，可能涉及到基因缺陷、代謝紊亂、氧化應(yīng)激及環(huán)境毒素等多方面[2]。在上世紀(jì)90年代，有研究發(fā)現(xiàn)炎癥參與了AD發(fā)病的病理生理學(xué)過程[3]，這一觀點(diǎn)在臨床上也逐漸得到證實(shí)[4]。后來大量研究也報(bào)道了神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病中的重要作用[5]，同時(shí)也試圖通過構(gòu)建各種炎癥動(dòng)物模型模擬AD的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，旨在用于AD發(fā)病機(jī)制的深入研究及防治AD的新藥研究。其中，較為成熟的有側(cè)腦室植管、單側(cè)或者雙側(cè)注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)AD樣神經(jīng)炎癥動(dòng)物模型等[6]，但這些模型存在操作繁瑣、模擬AD樣神經(jīng)炎癥不夠全面等缺點(diǎn)。因此，繼續(xù)探索操作簡單且能夠較為全面模擬AD樣神經(jīng)炎癥的動(dòng)物模型具有重要意義。本研究對(duì)反復(fù)腹腔注射LPS建立AD樣神經(jīng)炎癥的大鼠模型進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠25只，體重210g±10 g，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0005。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑 MT-200 Morris水迷宮：成都泰盟科技公司產(chǎn)品；全自動(dòng)凝膠圖象分析儀：美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；脂多糖：購自美國Sigma公司；兔抗大鼠APP、β-分泌酶、Aβ1-40、TNF-α、IL-1β、COX-2抗體：購自英國Abcom公司；p-NF-κB-p65、NF-κB-p65、IκB-α、β-actin購自美國Cell Sinnaling公司；BCA蛋白濃度含量測(cè)定試劑ECL發(fā)光劑：購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 動(dòng)物分組及處理 25只大鼠隨機(jī)分為2組，空白對(duì)照組(n=10)和模型組(n=15)。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，ip給予 LPS 0.5 mg/kg，每周1次, 連續(xù)13周，空白對(duì)照組注射等體積溶媒。實(shí)驗(yàn)過程監(jiān)測(cè)大鼠體重并觀察其一般情況。

1.4 Morris水迷宮檢測(cè) 末次注射LPS后，次日采用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，Morris水迷宮組成及檢測(cè)方法參照本課題組既往方法[7]，通過定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期反映大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.5 HE染色 水迷宮測(cè)試完畢后，每組隨機(jī)抽取3只大鼠，經(jīng)10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦，常規(guī)石蠟包埋, 冠狀切片, 厚度5 μm, 每隔2張取1張，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.6 透射電鏡 水迷宮測(cè)試完畢后，每組隨機(jī)抽取3只大鼠用于透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)的超微結(jié)構(gòu)，取材及操作按文獻(xiàn)進(jìn)行[8]。

1.7 Western blot 各組剩余大鼠海馬均用于Western blot檢測(cè)，取材方法及操作按本課題組既往方法進(jìn)行[7-8]。簡言之，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，IL-1β(1∶5000)、TNF-α(1∶2000)、COX-2(1∶1000)、IκB-α(1∶2000)、p-NF-κB-p65(1∶1000)、NF-κB-p65(1∶1000)、APP(1∶2000)、β-分泌酶(1∶2000)、Aβ1-40(1∶2000)及β-actin(1∶1000)過夜，洗膜，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5000)室溫孵育90 min，洗膜，ECL發(fā)光，曝光后凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠一般情況及學(xué)習(xí)記憶的影響 實(shí)驗(yàn)過程中，每次腹腔注射LPS后，大鼠在第1、2天體重下降或不增，但至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組大鼠的體重并無差異，一般狀態(tài)也未見差別。末次注射LPS后，次日采用Morris水迷宮檢測(cè)了大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)第1、2天兩組大鼠的逃避潛伏期無差異，第3、4天模型組大鼠的逃避潛伏期較對(duì)照組明顯延長(P<0.05)，這表明反復(fù)腹腔注射LPS可誘導(dǎo)大鼠的學(xué)習(xí)記憶減退(見圖1)。

注：資料以表示，n=10～15，與對(duì)照組比較，*P<0.05。 圖1 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

2.2 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響 HE染色觀察了大鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元形態(tài)。對(duì)照組神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞量多，排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞膜完整，核仁清晰(見圖2A)。而模型組神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死較多，結(jié)構(gòu)混亂不清，細(xì)胞質(zhì)呈空泡狀、胞核出現(xiàn)不同程度的溶解(見圖2B)。

注：A:對(duì)照組；B:LPS組。圖2 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響(×100)

2.3 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元可見細(xì)胞核和胞質(zhì)，胞核較大，呈圓形或卵圓形，胞體內(nèi)含較發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、高爾基復(fù)合體及神經(jīng)絲等(見圖3A)。然而，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞核未見明顯異常，部分細(xì)胞器腫脹，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張為主，部分線粒體嵴擴(kuò)張(見圖3B)。

注:A.對(duì)照組；B.LPS組?！緝?nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，↑示線粒體嵴擴(kuò)張。圖3 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

2.4 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬APP-Aβ代謝途徑的影響 本研究采用Western blot檢測(cè)了大鼠海馬APP-Aβ代謝途徑中的關(guān)鍵蛋白表達(dá)及終產(chǎn)物Aβ1-40含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反復(fù)腹腔注射LPS后大鼠海馬APP及β-分泌酶表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，而且終產(chǎn)物Aβ1-40含量也較對(duì)照組明顯增加(見圖4)。

注:A: APP、β-分泌酶及Aβ1-40的代表性條帶；B: APP表達(dá)的定量分析；C:β-分泌酶表達(dá)的定量分析；D: Aβ1-40含量的定量分析。資料以表示，n=3,**P < 0.01 control。圖4 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬APP-Aβ代謝途徑的影響

2.5 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響 本研究采用Western blot檢測(cè)了大鼠海馬TNF-α、IL-1β及COX-2等炎癥因子的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反復(fù)腹腔注射LPS后大鼠海馬TNF-α、IL-1β及COX-2等炎癥因子的蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加(見圖5)。

注：A: TNF-α、IL-1β及COX-2蛋白表達(dá)的代表性條帶；B：TNF-α表達(dá)的定量分析；C：大鼠海馬IL-1β表達(dá)的定量分析；D： COX-2蛋白表達(dá)的定量分析。資料以表示，n=3. **P < 0.01 vs control。圖5 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響

2.6 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬IκB-α含量及NF-κB p65磷酸化的影響 為進(jìn)一步探索反復(fù)腹腔注射LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β及COX-2等炎癥因子產(chǎn)生的作用機(jī)制，采用Western blot檢測(cè)了IκB-α含量及NF-κB p65磷酸化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反復(fù)腹腔注射LPS后，IκB-α含量較對(duì)照組明顯降低，而p-NF-κB p65水平較對(duì)照組明顯增加(見圖6)。

注:A：IκB-α含量的代表性條帶；B： p-NF-κB p65水平的代表性條帶；C： IκB-α含量的定量分析；D：p-NF-κB p65水平的定量分析。資料以表示，n=3. **P < 0.01 vs control。圖6 反復(fù)腹腔注射LPS對(duì)大鼠海馬IκB-α含量及NF-κB p65磷酸化的影響

3 討論

AD的主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能減退，學(xué)習(xí)記憶首先受累。因此，一個(gè)成熟的AD動(dòng)物模型首先必須能夠模擬學(xué)習(xí)記憶功能的減退。在本研究中，反復(fù)腹腔注射LPS后，大鼠逃避潛伏期較對(duì)照組明顯延長。逃避潛伏期主要反映大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，逃避潛伏期越長，表明大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力越低下[8]。本研究表明，反復(fù)腹腔注射LPS可誘導(dǎo)大鼠的學(xué)習(xí)記憶減退，與急性側(cè)腦室注射LPS誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退一致[8]。學(xué)習(xí)記憶中樞在海馬。既往研究發(fā)現(xiàn)，大鼠側(cè)腦室注射細(xì)菌內(nèi)毒素LPS后，可出現(xiàn)大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷及超微結(jié)構(gòu)改變[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)腹腔注射LPS后，大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死較多，結(jié)構(gòu)混亂不清晰，細(xì)胞質(zhì)呈空泡狀、胞核出現(xiàn)不同程度的溶解，而且CA1區(qū)神經(jīng)元部分細(xì)胞器腫脹，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張為主，部分線粒體嵴擴(kuò)張。這提示反復(fù)腹腔注射LPS可誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)損傷，與大鼠側(cè)腦室注射LPS所致的神經(jīng)元損傷結(jié)果一致[8-9]。

AD的主要病理學(xué)特征之一為細(xì)胞外老年斑，主要由于Aβ1-40/42沉積所致。本研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)腹腔注射LPS后，大鼠海馬APP及β-分泌酶表達(dá)明顯增加，終產(chǎn)物Aβ1-40含量也明顯增加。提示反復(fù)腹腔注射LPS可誘導(dǎo)大鼠海馬的特征性病理生理學(xué)Aβ沉積改變。已有研究表明神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病中的重要的作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)腹腔注射LPS后大鼠海馬的炎癥因子TNF-α、IL-1β及COX-2等蛋白表達(dá)明顯增加，與大鼠側(cè)腦室注射產(chǎn)生的炎性變化一致[8-9]。

已有研究認(rèn)為TNF-α、IL-1β及COX-2等炎癥因子的蛋白表達(dá)增加與NF-κB通路的激活有關(guān)，因此本研究檢測(cè)了大鼠海馬IκB-α含量及NF-κB p65磷酸化水平。NF-κB為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，常以二聚體或異二聚體的形式存在，其中最常見的NF-κB二聚體由p65與 p50組成，主要調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)[10]。IκB為NF-κB的抑制單位，其C末端特定的錨蛋白重復(fù)序列與NF-κB結(jié)合，并覆蓋NLS阻止NF-κB向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。細(xì)胞在靜息狀態(tài)中，NF-κB和IκB二者形成復(fù)合體，在胞漿中以無活性形式存在。當(dāng)細(xì)胞受到胞外信號(hào)刺激后，IκB激酶復(fù)合體激活，IκB磷酸化，并將NF-κB暴露核定位位點(diǎn)。游離的NF-κB迅速移位至細(xì)胞核并與特異性κB序列結(jié)合，從而誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，包括炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β及COX-2等[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)腹腔注射LPS后，IκB-α降解及p-NF-κB p65水平明顯增加，從而導(dǎo)致炎癥相關(guān)因子表達(dá)。

故可認(rèn)為，反復(fù)腹腔注射LPS后，大鼠在行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)及分子生物學(xué)等多方面都產(chǎn)生了AD樣神經(jīng)炎癥改變，該制模方法與既往方法比較，建模時(shí)間長，更能模擬AD這一慢性神經(jīng)炎癥過程。同時(shí)，腹腔注射不用開顱、不用埋管，操作簡單?？傊磸?fù)腹腔注射脂多糖誘導(dǎo)大鼠AD樣神經(jīng)炎癥，該模型操作簡單、穩(wěn)定，可用于大鼠AD樣神經(jīng)炎癥的發(fā)生機(jī)制研究及抗AD藥物評(píng)價(jià)。

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