石榴皮鞣花酸對4T1乳腺癌小鼠免疫功能的影響

張玉梅，王家曉

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

論 著

石榴皮鞣花酸對4T1乳腺癌小鼠免疫功能的影響

張玉梅，王家曉

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

目的 探討石榴皮鞣花酸對人乳腺癌4T1細(xì)胞株生長的抑制作用及對乳腺癌荷瘤小鼠免疫功能的影響。方法 測定石榴皮鞣花酸對體外培養(yǎng)的4T1細(xì)胞生長的抑制率；流式細(xì)胞儀測定腫瘤細(xì)胞凋亡情況；檢測應(yīng)用石榴皮鞣花酸后荷瘤小鼠的脾淋巴細(xì)胞的NK、LAK、CTL活性及血清TNF活性改變，并與對照組比較。結(jié)果 石榴皮鞣花酸抑制4T1細(xì)胞生長形成；流式細(xì)胞儀顯示石榴皮鞣花酸可有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；石榴皮鞣花酸低劑量組和高劑量組均可明顯誘導(dǎo)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞NK、LAK和CTL活性提高,且血清TNF水平明顯上升，與生理鹽水組、DDP組比較均有顯著性差異(P均<0.05)。石榴皮鞣花酸低劑量組與高劑量組均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論 石榴皮鞣花酸可明顯抑制4T1細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡，石榴皮鞣花酸可明顯誘導(dǎo)提高荷瘤小鼠特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。

石榴皮鞣花酸;乳腺癌;小鼠；免疫功能

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一。多年來，乳腺癌發(fā)病率在發(fā)達國家一直占女性惡性腫瘤的首位。近年來中國的乳腺癌發(fā)病率在逐年上升且出現(xiàn)年輕化的趨勢。據(jù)統(tǒng)計，全球乳腺癌新發(fā)病例在過去30 a間(1980年—2010年)逐年上升，年增長率達3.1%。有報道，2010年全世界乳腺癌患病人數(shù)更是高達1 643 000(1 421 000～1 782 000)人[1]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因參與的、多階段的復(fù)雜過程，是細(xì)胞中多種基因表達改變累積的結(jié)果，在此過程中既有原癌基因的激活與抑癌基因的失活，也有細(xì)胞周期的調(diào)控和凋亡基因的改變以及細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)的紊亂[2]。石榴皮是石榴科植物石榴的干燥果皮，性酸、味澀，具有澀腸、止血、殺蟲的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石榴皮具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和抗氧化等作用，從其中提取的鞣花酸具有很強的抗腫瘤活性[3]。本研究觀察了石榴皮鞣花酸對乳腺癌4T1細(xì)胞體外增殖和細(xì)胞凋亡的影響及其對乳腺癌4T1荷瘤小鼠的腫瘤抑制情況，以探討石榴皮鞣花酸可能的抗癌機制。

1 實驗資料

1.1 主要儀器及試劑 純系BALB/C小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物部。小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞株由廣西中醫(yī)藥大學(xué)免疫學(xué)實驗室惠贈。RPMI1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司生產(chǎn)。胎牛血清為美國HyClone公司生產(chǎn)。石榴皮鞣花酸購自上海譜振生物科技有限公司，純度為96%。SP試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。CCK-8殺傷活性測定試劑盒購自Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPMI1640于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次，0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液進行不同的實驗。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取處于指數(shù)增殖期的小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞，按照不同的細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀上450 nm比色測吸光度值，根據(jù)檢測結(jié)果繪制細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞增殖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測 取處于指數(shù)增殖期的腫瘤細(xì)胞按照5×104mL-1接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)置對照和實驗組，每個劑量和對照均設(shè)3復(fù)孔。實驗組加入不同濃度石榴皮鞣花酸(10，20，30 g/L)，對照組和DDP組分別加等量的生理鹽水和DDP，加藥共培養(yǎng)48 h后加入CCK-8，同上檢測細(xì)胞450 nm比色測吸光度值，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/陰性對照組OD值)×100%。

1.4 細(xì)胞周期分析 取指數(shù)增殖期的小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞種植于6孔板中，細(xì)胞種植密度為104mL-1，每孔3 mL。設(shè)置對照和實驗組，實驗組加入不同濃度石榴皮鞣花酸(10，20，30 g/L)，對照組加生理鹽水，共培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，使用30%PBS乙醇重懸細(xì)胞沉淀，搖勻后向細(xì)胞懸液中加入5 mL的PI，閉光作用5 min后上機檢測細(xì)胞周期。

1.5 小鼠4T1乳腺癌荷瘤小鼠的建立 6周齡BALB/C小鼠右側(cè)腋窩皮下接種小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞0.1 mL(含5×105個小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞)，12 d左右腫瘤直徑達0.5 cm大小時即成小鼠4T1乳腺癌荷瘤小鼠。

1.6 觀察石榴皮鞣花酸對乳腺癌荷瘤小鼠的保護作用 將52只BALB/C乳腺癌荷瘤小鼠隨機分為4組：石榴皮鞣花酸高劑量組、石榴皮鞣花酸低劑量組、DDP組和生理鹽水組，每組13只。接種小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞后第2天開始灌胃，連續(xù)灌胃給藥10 d，鞣花酸高劑量組每天1次灌注0.4 mL鞣花酸高濃度稀釋液(相當(dāng)于鞣花酸30 g/L)，鞣花酸低劑量組每天1次灌注0.4 mL鞣花酸低濃度稀釋液(相當(dāng)于鞣花酸10 g/L)，DDP組每天1次灌注0.4 mL DDP稀釋液(相當(dāng)于DDP 5 g/L)，生理鹽水組每天1次灌注0.4 mL生理鹽水。連續(xù)喂養(yǎng)3周。另外以13只正常小鼠每天1次灌注0.4 mL生理鹽水作為對照組。

1.7 小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫功能測定 測定各組NK、LAK、CTL活性和TNF水平。

1.7.1 各組小鼠脾NK、LAK、CTL活性檢測 連續(xù)喂養(yǎng)3周后無菌取出BALB/C小鼠脾臟，體外制成脾淋巴細(xì)胞懸液，培養(yǎng)液中加入50 IU/mL rhIL-2進行培養(yǎng)。參照文獻[4]采用LDH 4 h釋放法進行測定(按試劑盒說明書操作)。

1.7.2 各組小鼠血清TNF水平檢測 上述各組小鼠在連續(xù)喂養(yǎng)3周后處死，在處死前先以拔眼球法分別提取各小鼠的全血2 mL，室溫放置4 h，離心2 000 r/min，25 min后分離出血清。以血清作為待測樣品，置于-20 ℃冰箱中貯存?zhèn)錅y。參照文獻[5]采用LDH 4 h釋放法進行測定(按試劑盒說明書操作)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組均數(shù)的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 石榴皮鞣花酸對小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 石榴皮鞣花酸對小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。不同濃度的鞣花酸組對小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞抑制增殖作用的時間曲線基本相同，都是在培養(yǎng)48 h時最明顯。鞣花酸20 g/L組與30 g/L組的抑制增殖作用與10 g/L組比較有顯著性差異(P均<0.05)。但20 g/L組與30 g/L組比較無顯著性差異，提示鞣花酸對小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞的增殖可能有飽和抑制作用。見表1。

表1 各組對小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

注：①與生理鹽水組比較，P<0.05；②與鞣花酸低劑量組比較，P<0.05。

2.2 各組對小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡計數(shù)結(jié)果顯示，不同濃度石榴皮鞣花酸在一定時間范圍內(nèi)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用隨藥物濃度及作用時間的增加而增強，但當(dāng)鞣花酸到達一定濃度(20 g/L)后凋亡誘導(dǎo)作用逐漸趨向穩(wěn)定。見圖2～圖4。

圖2 石榴皮鞣花酸低劑量細(xì)胞凋亡情況

圖3 石榴皮鞣花酸中劑量細(xì)胞凋亡情況

圖4 石榴皮鞣花酸高劑量細(xì)胞凋亡情況

2.3 細(xì)胞周期分析 不同濃度鞣花酸與小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯變化，G1期的細(xì)胞均增加明顯，G2/M期的細(xì)胞出現(xiàn)減少，并且可見到較明顯的凋亡峰形成。各濃度組G1期細(xì)胞與生理鹽水組比較均有顯著性差異(P均<0.05)；鞣花酸3個濃度組中，低濃度組與中濃度組和高濃度組比較均有顯著性差異(P均<0.05)，但中濃度組與高濃度組比較無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞周期分布比較±s，%)

注：①與生理鹽水組比較，P<0.05；②與石榴皮鞣花酸低劑量組比較，P<0.05。

2.4 各組小鼠NK、LAK、CTL和TNF活性比較 各組NK、LAK、CTL和TNF活性比較均有顯著性差異(P均<0.05)。各實驗組NK、LAK、CTL活性和血清TNF水平均較對照組低(P均<0.05)，DDP組NK、LAK、CTL活性和血清TNF水平均較生理鹽水組荷瘤小鼠降低(P均<0.05)。石榴皮鞣花酸低劑量組和高劑量組NK、LAK、CTL活性和血清TNF水平均較生理鹽水組、DDP組高(P均<0.05)，但仍低于正常小鼠的水平(P<0.05)，提示石榴皮鞣花酸可明顯改善荷瘤小鼠的免疫功能狀態(tài)。石榴皮鞣花酸低劑量組NK、LAK、CTL活性和血清TNF水平與高劑量組比較無顯著性差異(P均>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠NK、LAK、CTL和TNF活性比較

注：①與生理鹽水組比較,P<0.05;②與DDP組比較,P<0.05；③與對照組比較,P<0.05。

3 討 論

乳腺癌是全球現(xiàn)代女性最常見惡性腫瘤之一，占癌癥總發(fā)病率的29%，也是女性癌癥死亡的首要原因，占癌癥死亡率的14%，嚴(yán)重危害婦女身心健康。目前普遍認(rèn)為乳腺癌是多因素作用、多基因參與、多階段發(fā)展的疾病，導(dǎo)致乳腺癌常見發(fā)病因素包括遺傳、內(nèi)分泌、飲食及物理因素，其中遺傳因素中涉及眾多癌基因和抑癌基因失衡、信號通路傳導(dǎo)異常和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的改變等。然而其發(fā)生和發(fā)展的確切機制尚未闡明[6]。

在本研究中，石榴皮鞣花酸對4T1乳腺癌細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，可誘導(dǎo)4T1乳腺癌細(xì)胞凋亡，荷瘤小鼠經(jīng)胃灌注石榴皮后腫瘤生長受到明顯抑制，這些均表明石榴皮鞣花酸具有明顯的抗腫瘤作用。然而，當(dāng)石榴皮鞣花酸濃度升到一定值后，對腫瘤細(xì)胞的抑制作用往往逐漸呈飽合狀態(tài)，石榴皮鞣花酸低劑量細(xì)胞抑制率與中劑量組比較無顯著性差異，表明石榴皮鞣花酸雖然對腫瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，但與化療藥物相比，石榴皮鞣花酸可能主要通過對腫瘤細(xì)胞周期的改變引起腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡受抑導(dǎo)致病變組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞存活時間延長，破壞細(xì)胞群體內(nèi)存活與死亡的平衡，存活細(xì)胞數(shù)大于死亡細(xì)胞數(shù)，則腫瘤細(xì)胞數(shù)量凈增多[7]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展往往伴隨著機體免疫功能下降，本文結(jié)果顯示，荷瘤小鼠免疫細(xì)胞較正常小鼠出現(xiàn)明顯下降，而荷瘤小鼠應(yīng)用DDP治療后免疫力下降更明顯，石榴皮低劑量組和高劑量組NK、LAK、CTL活性和血清TNF水平均較生理鹽水組和DDP組高，但均低于正常小鼠的水平，提示石榴皮鞣花酸可明顯改善荷瘤小鼠的免疫功能狀態(tài)。石榴皮鞣花酸低劑量組NK、LAK、CTL活性和血清TNF水平與高劑量組比較無顯著性差異，表明石榴皮鞣花酸對機體免疫功能的激活可能有飽和效應(yīng)，這也是其治療的瓶頸所在。石榴皮鞣花酸治療后荷瘤小鼠腫瘤稍縮小，腫瘤大小與其他各組相比均有顯著性差異，表明石榴皮鞣花酸過繼免疫后不僅有助于小鼠機體免疫功能的恢復(fù)，同時激活機體免疫系統(tǒng)對腫瘤產(chǎn)生特異性的抗瘤作用。

綜上所述，石榴皮鞣花酸可以增強荷瘤小鼠的免疫功能，研究開發(fā)石榴皮鞣花酸免疫增強劑具有實際意義和廣闊的應(yīng)用前景。

[1] Forouzanfar MH,Foreman KJ,Delossantos AM,et al. Breast and cervical cancer in 187 countries between 1980 and 2010：a systematic analysis[J]. Lancet,2011,378(9801):1461-1484

[2] Thornton H. New citizens’juries in breast screening review are biased[J]. BMJ,2012,345:7552-7555

[3] 杜欣,葉盛英. 石榴葉和石榴皮藥理活性研究進展[J]. 天津藥學(xué)，2007,19(2):64-66

[4] Chen HY,Wu SL,Yeh MY,et al. Antimetastatic activity induced by clostridium butyricum and characterization of effector cells[J]. Anticancer Res,2005,13(1):107-111

[5] Decker T,Lohmann-Matthes ML. A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity[J]. J Immunol Meth,2008,115(4):61-69

[6] Emens LA. Breast cancer immunobiology driving immunotherapy:vaccines and immune checkpoint blockade[J]. Expert Rev Anticancer Ther，2012,12(12):1597-1611

[7] Basu S,Ma R,Moskal JR,et al. Apoptosis of breast cancer cells: modulation of genes for glycoconjugate biosynthesis and targeted drug delivery[J]. Adv Exp Med Biol，2012,749:233-255

Influence of pomegranate peel ellagic acid on immune function of mice with 4T1 breast cancer

Zhang Yumei, Wang Jiaxiao

(The Affiliated First Hospital of Guangxi Traditional Medical University, Nanning 530023, Guangxi, China)

Objective It is to observe the inhibitory action of pomegranate peel ellagic acid on human 4T1 breast cancer cell and its influence on immune function in breast tumor-bearing mice. Methods The growth inhibition rate of pomegranate peel ellagic acid on 4T1 cell cultured in vitro was detected; the tumor cell apoptotic ratio was measured by flow cytometry; the changes of NK, LAK, CTL activity in spleen lymphocytes and serum TNF of tumor-bearing mice were detected after treated by pomegranate peel ellagic acid, and compared with the control group. Results The growth and formation of 4T1 cells were inhibited by pomegranate peel ellagic acid. Flow cytometry showed that pomegranate peel ellagic acid could induce apoptosis effectively. Pomegranate peel ellagic acid low-dose and high-dose groups could significantly enhance the induction of tumor-bearing mouse spleen lymphocytes NK, LAK and CTL activity, and the serum TNF levels were significantly increased, there were significant difference compared with the saline group or DDP group (P<0.05). There was no significant difference between pomegranate peel ellagic acid low-dose and high-dose groups (P>0.05). Conclusion Pomegranate peel ellagic acid can inhibit the proliferation and induce apoptosis in 4T1 cells. Pomegranate peel ellagic acid can significantly improve tumor-bearing mice induce specific anti-tumor immune response.

pomegranate peel ellagic acid; breast cancer; mouse; immune function

張玉梅，女，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科臨床研究工作。

王家曉，Tel:13005900116,E-mail:zhzm09@163.com

廣西自然科學(xué)基金項目(2010GXNSFA013213)；廣西青年基金項目(2011GXNSFB018104)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)院級重點課題(2D2009003)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)院級課題(P2009129)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.15.001

R-332

A

1008-8849(2014)15-1597-04

2013-12-10