Cry1Ba3蛋白對(duì)亞洲玉米螟殺蟲(chóng)活性測(cè)定及其與BBMVs的結(jié)合分析

尹鳳翔，孫 凱，束長(zhǎng)龍，宋福平，張 杰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

Cry1Ba3蛋白對(duì)亞洲玉米螟殺蟲(chóng)活性測(cè)定及其與BBMVs的結(jié)合分析

尹鳳翔，孫 凱，束長(zhǎng)龍，宋福平，張 杰*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

提取并純化Cry1Ba3蛋白截短片段，用飼喂人工飼料的方法對(duì)亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)初孵幼蟲(chóng)進(jìn)行生物活性測(cè)定。結(jié)果顯示，Cry1Ba3截短片段對(duì)亞洲玉米螟有良好的殺蟲(chóng)活性(LC50=5.29 μg/g，95%置信限為3.96～7.10μg/g)。而純化的Cry1Ac蛋白60ku的活性片段對(duì)亞洲玉米螟初孵幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性L(fǎng)C50為0.83μg/g。提取亞洲玉米螟5齡幼蟲(chóng)的BBMVs，用純化的Cry1Ba3和Cry1Ac蛋白進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，結(jié)果顯示Cry1Ba3與Cry1Ac在亞洲玉米螟中腸的結(jié)合沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)作用，說(shuō)明兩種毒素在亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs上可能存在不同的受體。

Cry1Ba3蛋白； Cry1Ac蛋白； 亞洲玉米螟； 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合

亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)]主要為害玉米、高粱、谷子等作物，造成顆粒缺失甚至絕收。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)將包括cry1Ab、cry1Ac、cry1Ah、cry1Fa、cry1Ie等多種Bt殺蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入玉米中[1-3]，對(duì)亞洲玉米螟和歐洲玉米螟[OstrinianubilalisHübner)]等鱗翅目害蟲(chóng)具有良好的防治效果[4-5]。截至2012年底，全球轉(zhuǎn)基因玉米種植面積高達(dá)5 510萬(wàn)hm2，充分顯示了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值[6]。然而，大面積種植轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)作物不可避免地引發(fā)害蟲(chóng)對(duì)其產(chǎn)生抗性[7-8]。與此同時(shí)，室內(nèi)人工汰選結(jié)果顯示，亞洲玉米螟對(duì)Cry1Ac、Cry1Ab蛋白也會(huì)產(chǎn)生抗性[9]。因此，為延緩害蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生，發(fā)掘與已商業(yè)化應(yīng)用的基因無(wú)交互抗性的新的Bt基因成為一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。

cry1Ba3基因是由本實(shí)驗(yàn)室克隆的殺蟲(chóng)毒素基因，其編碼的Cry1Ba3蛋白對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)小菜蛾[Plutellaxylostella( Linnaeus)]、鞘翅目葉甲科害蟲(chóng)馬鈴薯甲蟲(chóng)[Leptinotarsadecemlineata(Say)]等均有良好毒殺活性，已用于工程菌構(gòu)建[10]。目前已經(jīng)確定Cry1Ba3對(duì)小菜蛾的最小活性區(qū)為第22位到第655位氨基酸[11]，蛋白結(jié)構(gòu)域II上loop2(或者與loop1一起)對(duì)毒素蛋白的毒力影響較大，而loop3的改變對(duì)Cry1Ba蛋白的殺蟲(chóng)活性沒(méi)有顯著影響[12]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Cry1Ba3蛋白對(duì)Cry1Ac抗性小菜蛾有良好的殺蟲(chóng)活性，說(shuō)明這兩種毒素蛋白在小菜蛾上并無(wú)交互抗性[13]。

Bt Cry蛋白與昆蟲(chóng)中腸刷狀緣膜囊泡(brush border membrane vesicles，簡(jiǎn)稱(chēng)BBMVs)上受體結(jié)合是發(fā)揮殺蟲(chóng)作用的關(guān)鍵步驟[14]。近年來(lái)隨著Cry蛋白殺蟲(chóng)機(jī)理研究不斷深入，來(lái)自昆蟲(chóng)的新受體不斷被發(fā)現(xiàn)，糖基化磷脂酰肌醇(即GPI)錨定的氨肽酶N(APN)、糖基化磷脂酰基醇錨定的堿性磷酸酶(ALP)和類(lèi)鈣黏蛋白(Cad)相繼被證實(shí)是Cry毒素在昆蟲(chóng)體內(nèi)主要的受體種類(lèi)[15-17]。

在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上，本研究測(cè)定了Cry1Ba3對(duì)亞洲玉米螟的殺蟲(chóng)活性；比較了Cry1Ba3蛋白與Cry1Ac蛋白在亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs上的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用，為Cry1Ba3蛋白商業(yè)化應(yīng)用和殺蟲(chóng)機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究中用到的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1菌株與質(zhì)粒

Table1Strainsandplasmids

菌株和質(zhì)粒Strainsandplasmids特征Characterization來(lái)源Source菌株StrainsEscherichiacoliBL21F-，ompT，hsdSB(r-Bm-B)，gal(λcⅠ857，ind1，Sam7，nin5，lacUV5-T7gene1)，dcm(DE3)本實(shí)驗(yàn)室InthislabHD73B．thuringiensissubsp．kurstaki，carryingcry1Acgene本實(shí)驗(yàn)室Inthislab質(zhì)粒PlasmidspET?1Ba3?3HAmpR，7．3kb，containing1．9kbcry1Ba3gene本實(shí)驗(yàn)室Inthislab

1.2 主要試劑和儀器

蛋白High range marker 購(gòu)自賽默飛公司，鎳親和層析柱填料(chelating sepharose fast flow)購(gòu)自GE公司，生物素(N-hydroxysuccinimidobiotin，NHS-Biotin)、堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素(avidin-alkaline phosphatase，AP-avidin)等購(gòu)自Sigma公司，蛋白Prestained precision plus marker、蛋白定量試劑盒購(gòu)自Bio-Rad公司，堿性磷酸酶底物顯色試劑盒購(gòu)自冰達(dá)公司。

Beckman高速離心機(jī)Avanti J-26xp；德國(guó)臺(tái)式Eppendorf 離心機(jī)5415C；美國(guó)Bio-Rad公司Mini protein Ⅲ蛋白電泳儀；美國(guó)GE公司高效液相色譜系統(tǒng)AKTA avant 25。

1.3 供試?yán)ハx(chóng)

亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)初孵幼蟲(chóng)和5齡幼蟲(chóng)由北京綻諾斯特公司提供。

1.4 Cry1Ba3蛋白的表達(dá)與提取

將攜帶有cry1Ba3半長(zhǎng)基因質(zhì)粒pET-1Ba3-3H的大腸桿菌BL21接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基[18]中，37 ℃、220r/min活化過(guò)夜；1%接種于300mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220r/min培養(yǎng)至A600到0.5左右；加入IPTG至終濃度為1mmol/L，18 ℃、150r/min誘導(dǎo)16h。離心收集菌體，將菌體懸浮于20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液中。超聲破碎細(xì)胞10min(超聲功率：80%，超聲：5 s，暫停：5 s)，12 000r/min離心10min，收集上清，沉淀用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液懸??；用SDS-PAGE電泳分析蛋白提取情況。

1.5 Cry1Ba3蛋白的親和層析純化

取1mL鎳親和層析柱填料裝入層析柱，用5倍柱體積的超純水清洗層析柱；加入1倍柱體積的0.1mol/L NiSO4，用移液器吸打混勻，室溫靜置10min，再用5倍柱體積的超純水洗柱子；加入5倍柱體積的平衡緩沖液(20mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.5 mol/L NaCl，20mmol/L咪唑)平衡柱子，將Cry1Ba3蛋白上清液上樣，接流穿的液體；待樣品上完后，用3×5倍柱體積的平衡緩沖液洗去雜蛋白；用1倍柱體積的洗脫緩沖液1(20mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.5 mol/L NaCl，200mmol/L咪唑)洗脫下目的蛋白并收集，重復(fù)4次；用5倍柱體積的洗脫緩沖液2(20mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.5 mol/L NaCl，1mol/L咪唑) 洗脫下雜蛋白；加入各種清洗緩沖液(2 mol/L NaCl，1mol/L NaOH，70%乙醇)進(jìn)行清洗；加入再生緩沖液(0.5 mol/L NaCl，0.05 mol/L EDTA，0.5 mol/L NaCl)將層析柱再生；SDS-PAGE檢測(cè)洗脫下來(lái)的蛋白樣品。

1.6 Cry1Ba3蛋白的凝膠過(guò)濾純化

用AKTA avant蛋白液相分析系統(tǒng)對(duì)經(jīng)過(guò)親和層析純化得到的Cry1Ba3溶液進(jìn)行緩沖液置換，將目的蛋白溶液以2 mL/min的流速通過(guò)Hitrap 脫鹽層析柱，然后用磷酸緩沖液同樣以2 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，分體積接樣并SDS-PAGE檢測(cè)。挑選高純度的Cry1Ba3蛋白溶液通過(guò)Centriplus YM30濃縮管(MilliPore公司)進(jìn)行濃縮。

1.7 Cry1Ac蛋白的提取、消化和純化

Cry1Ac蛋白的提取參見(jiàn)Xue等[19]的方法。將Cry1Ac蛋白與胰蛋白酶以質(zhì)量單位比10∶1混合后，37 ℃溫育，設(shè)時(shí)間梯度(1、2、3、4、5 h)進(jìn)行消化，SDS-PAGE檢測(cè)消化結(jié)果。消化后Cry1Ac蛋白的純化過(guò)程參見(jiàn)周子珊等[20]的方法。

1.8 亞洲玉米螟的生物活性測(cè)定

Cry1Ba3蛋白設(shè)置8個(gè)濃度，分別為：0.33、1.0、3.0、9.0、27.0、81.0和243.0μg/g；Cry1Ac蛋白設(shè)置8個(gè)濃度，分別為0.037、0.11、0.33、1.0、3.0、9.0和27.0μg/g。生物活性測(cè)定過(guò)程參考韓海亮等[9]的方法。7 d調(diào)查結(jié)果，用SPSS軟件對(duì)亞洲玉米螟生測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 Cry殺蟲(chóng)蛋白的生物素標(biāo)記

稱(chēng)取2.2 mg Sulfo-NHS-SS-Biotin溶于360μL超純水中，配制成10mmol/L溶液，向待標(biāo)記蛋白溶液中加入20倍摩爾量的生物素溶液，室溫靜置4 h，離心除去過(guò)量的生物素。Western blotting雜交檢測(cè)標(biāo)記效果，并用堿性磷酸酶AP系統(tǒng)顯色，操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.10 亞洲玉米螟中腸BBMVs的提取及定量

亞洲玉米螟5齡幼蟲(chóng)BBMVs的提取方法參考Wolfersberger方法[21]，然后用Bradford法(Bio-Rad試劑盒)對(duì)BBMVs進(jìn)行總蛋白定量，操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.11 毒素蛋白與亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs體外結(jié)合試驗(yàn)

在BBMV中加入適量標(biāo)記好的毒蛋白，用含0.1% BSA的PBS補(bǔ)足至100μL，室溫反應(yīng)1h。18 000r/min離心10min后，用500μL含0.1% BSA的PBS緩沖液洗滌2次。加入10μL 1×SDS上樣緩沖液后煮沸5 min，12 000r/min離心5 min，吸取上清，進(jìn)行SDS-PAGE。采用Bio-rad裝置，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，膜在TBST中漂洗后置于封閉液中。緩慢搖動(dòng)，室溫封閉1h。之后棄封閉液，加入用PBS稀釋的AP-Avidin，室溫輕搖1h。用TBST浸洗PVDF膜3次，每次15 min。最后用NBT/BCIP試劑顯色。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)與結(jié)合的步驟大致相同，只是在加入標(biāo)記蛋白的同時(shí)加入不同種類(lèi)的過(guò)量未標(biāo)記的毒蛋白，同樣經(jīng)過(guò)室溫溫育1h，最終通過(guò)Western blotting雜交檢測(cè)其對(duì)標(biāo)記蛋白結(jié)合的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cry1Ba3蛋白提取與純化

用超聲破碎法從大腸桿菌BL21菌株中提取Cry1Ba3蛋白。經(jīng)DNAMAN軟件分析可知，截短的Cry1Ba3蛋白分子量約為71ku。 經(jīng)過(guò)鎳親和層析、透析并離心濃縮后最終得到Cry1Ba3蛋白的純化結(jié)果，見(jiàn)圖1。

圖1 SDS-PAGE分析純化的Cry1Ba3蛋白Fig.1 Analysis of purified Cry1Ba3protein by SDS-PAGE

2.2 Cry1Ac蛋白的提取、活化與純化

用等電點(diǎn)沉淀法從HD73菌株中提取Cry1Ac蛋白，表達(dá)出的Cry1Ac蛋白大小約為130ku，經(jīng)胰蛋白酶消化1h后，形成約60ku的活性片段。然后將樣品通過(guò)AKTA avant蛋白液相分析系統(tǒng)進(jìn)行陰離子交換層析、脫鹽柱層析并離心濃縮，最終得到純化的Cry1Ac蛋白(圖略)。

2.3 純化蛋白對(duì)亞洲玉米螟生物活性測(cè)定結(jié)果

經(jīng)純化的Cry1Ba3半長(zhǎng)蛋白對(duì)亞洲玉米螟的LC50=5.29 μg/g，95%置信限為3.96～7.10μg/g；Cry1Ac活化蛋白對(duì)亞洲玉米螟的LC50=0.83μg/g，95%置信限為0.66～1.07 μg/g。

2.4 亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs的提取和定量

從約2 500頭亞洲玉米螟5齡幼蟲(chóng)解剖獲得約10g中腸，分裝后凍存于-70℃冰箱。提取BBMVs經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析，條帶清晰，分布均勻，能滿(mǎn)足競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)要求(電泳圖略)。 Bradford法(Bio-Rad試劑盒)對(duì)BBMVs總蛋白定量，最終計(jì)算得BBMVs濃度為7.65 mg/mL。

2.5 結(jié)合試驗(yàn)

首先用生物素標(biāo)記的Cry1Ac蛋白與亞洲玉米螟的BBMVs進(jìn)行體外飽和結(jié)合試驗(yàn)，Western blotting檢測(cè)雜交結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示Cry1Ac可以與亞洲玉米螟的BBMVs結(jié)合。終濃度為153μg/mL的亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs與不同濃度的NHS-Biotin-Cry1Ac蛋白結(jié)合，發(fā)現(xiàn)從2.0μg/mL毒素蛋白濃度開(kāi)始，隨著蛋白濃度的逐漸增加，毒素與BBMVs結(jié)合量逐漸增加。當(dāng)NHS-Biotin-Cry1Ac蛋白濃度為32.0μg/mL時(shí)，與BBMV的結(jié)合量達(dá)到飽和。

圖2 BBMVs與NHS-Biotin-Cry1Ac結(jié)合的飽和度測(cè)定Fig.2 Determination of saturated binding between NHS-Biotin-Cry1Ac toxin and BBMVs

向亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs與Cry1Ac蛋白飽和結(jié)合的反應(yīng)體系中，分別加入5倍、10倍、100倍過(guò)量的未標(biāo)記的Cry1Ba3蛋白，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，用Western blotting檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)圖3。當(dāng)加入不同量未標(biāo)記的Cry1Ba3蛋白進(jìn)行異源競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，經(jīng)配體雜交熒光檢測(cè)顯示：標(biāo)記的Cry1Ac蛋白條帶的亮度沒(méi)有發(fā)生變化，即說(shuō)明對(duì)標(biāo)記的Cry1Ac蛋白與亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs的結(jié)合沒(méi)有影響(樣品2～4)，異源競(jìng)爭(zhēng)沒(méi)有發(fā)生；而加入等量未標(biāo)記的Cry1Ac蛋白進(jìn)行同源競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，配體雜交熒光檢測(cè)顯示Cry1Ac蛋白條帶的亮度變暗(樣品1)，即說(shuō)明標(biāo)記的Cry1Ac蛋白與亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs的結(jié)合作用減弱，發(fā)生了同源競(jìng)爭(zhēng)作用。

同樣，用生物素標(biāo)記的Cry1Ba3蛋白對(duì)亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs進(jìn)行飽和結(jié)合試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。終濃度為153μg/mL的亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs與不同濃度的NHS-Biotin-Cry1Ba3蛋白結(jié)合，發(fā)現(xiàn)從0.5 μg/mL毒素蛋白濃度開(kāi)始，隨著蛋白濃度的逐漸增加，毒素與BBMVs結(jié)合量逐漸增加。當(dāng)Cry1Ba3蛋白濃度為8.0μg/mL時(shí)，與BBMVs的結(jié)合量達(dá)到飽和。

圖3 對(duì)Cry1Ac與BBMVs結(jié)合的同源及異源競(jìng)爭(zhēng)Fig.3 Homologous and heterologous competition for NHS-Biotin-Cry1Ac binding to BBMVs

圖4 BBMVs與NHS-Biotin-Cry1Ba3結(jié)合的飽和度測(cè)定Fig.4 Determination of saturated binding between NHS-Biotin-Cry1Ba3toxin and BBMVs

向亞洲玉米螟B(niǎo)BMVs與標(biāo)記Cry1Ba3蛋白飽和結(jié)合的反應(yīng)體系中，分別加入100倍、300倍過(guò)量的未標(biāo)記Cry1Ac蛋白和10倍、100倍未標(biāo)記的Cry1Ba3蛋白，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，Western blotting檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。當(dāng)加入不同量未標(biāo)記的Cry1Ac蛋白進(jìn)行異源競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，經(jīng)配體雜交熒光檢測(cè)顯示標(biāo)記的Cry1Ba3蛋白條帶的亮度沒(méi)有發(fā)生變化，即說(shuō)明未發(fā)生異源競(jìng)爭(zhēng)作用(樣品2和3)，而加入10倍濃度未標(biāo)記的Cry1Ba3蛋白進(jìn)行同源競(jìng)爭(zhēng)時(shí)，標(biāo)記的 Cry1Ba3蛋白僅有很弱的條帶(樣品4)，加入100倍濃度未標(biāo)記的Cry1Ba3時(shí)標(biāo)記蛋白與BBMVs的結(jié)合被完全競(jìng)爭(zhēng)(樣品5)，發(fā)生了同源競(jìng)爭(zhēng)作用。

圖5 對(duì)Cry1Ba3與BBMVs結(jié)合的同源及異源競(jìng)爭(zhēng)Fig.5 Homologous and heterologous competition for NHS-Biotin-Cry1Ba3binding to BBMVs

3 討論

本研究提取并純化了Cry1Ba3蛋白，對(duì)亞洲玉米螟進(jìn)行生物活性測(cè)定，結(jié)果顯示截短的Cry1Ba3蛋白對(duì)亞洲玉米螟具有良好的殺蟲(chóng)活性，高于Cry1Ba3全長(zhǎng)蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。本研究中使用的Cry1Ba3蛋白是Cry1Ba3的71ku的N端活性區(qū)，包括第22位至655位氨基酸，昆蟲(chóng)攝入體內(nèi)以后可能會(huì)進(jìn)一步消化成為真正的活性片段。

本研究證明Cry1Ba3與Cry1Ac蛋白在亞洲玉米螟的BBMVs上沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)作用，表明兩種毒素蛋白在亞洲玉米螟B(niǎo)BMV上可能存在不同的受體。毒素與受體的結(jié)合在其發(fā)揮殺蟲(chóng)活性的過(guò)程中有關(guān)鍵的作用，也是昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的重要環(huán)節(jié)[22]。Sek Yee Tan等通過(guò)比較Cry1Ab和Cry1Fa與亞洲玉米螟和歐洲玉米螟B(niǎo)BMV的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)Cry1Ab或Cry1Fa分別在這兩類(lèi)玉米螟體內(nèi)有相似的受體，而在亞洲玉米螟或者歐洲玉米螟體內(nèi)這兩種Cry蛋白各自的高親和力受體并不相同，這也支持了之前報(bào)道的Cry1Ab和Cry1Fa在玉米螟上表現(xiàn)出低交互抗性的現(xiàn)象[23]。已經(jīng)證明Cry1Ba3對(duì)Cry1Ac抗性小菜蛾有很好的殺蟲(chóng)活性，為了探究Cry1Ba3與Cry1Ac在亞洲玉米螟上是否存在交互抗性，接下來(lái)需要將Cry1Ba3對(duì)亞洲玉米螟的抗性品系進(jìn)行生物活性測(cè)定。Cry1Ba3全長(zhǎng)蛋白和Cry1Ac全長(zhǎng)蛋白的氨基酸序列相似性為57%，結(jié)構(gòu)域Ⅱ區(qū)域的相似性為28%。大量的研究證明結(jié)構(gòu)域Ⅱ決定Cry毒素蛋白與昆蟲(chóng)受體的特異性結(jié)合[24]。所以今后可以選擇結(jié)構(gòu)域Ⅱ氨基酸序列相似性低的Cry毒素蛋白基因的組合作為綜合防治蟲(chóng)害和研發(fā)轉(zhuǎn)基因植物時(shí)的備選基因，有利于規(guī)避昆蟲(chóng)對(duì)Cry毒素蛋白產(chǎn)生交互抗性的風(fēng)險(xiǎn)。

Cry1Ba3和Cry1Ac蛋白的純化是本試驗(yàn)的關(guān)鍵。提取的Cry1Ba3半長(zhǎng)片段經(jīng)過(guò)鎳親和層析純化后溶液中咪唑濃度很高，影響后續(xù)生物素標(biāo)記試驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)的效果，需要通過(guò)透析的方法除去。用胰蛋白酶對(duì)Cry1Ac蛋白消化以后，溶液中有大量酶解下的小肽段，也會(huì)影響后續(xù)試驗(yàn)，所以需要對(duì)Cry1Ac進(jìn)行緩沖液置換。為得到純度較高的樣品，在用AKTA avant蛋白液相分析系統(tǒng)進(jìn)行純化時(shí)，色譜圖出峰后要小體積收集樣品，避免交叉污染。

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AnalysisofinsecticidalactivityofCry1Ba3proteinagainstOstriniafurnacalisandbindingassaywithBBMVs

Yin Fengxiang, Sun Kai, Shu Changlong, Song Fuping, Zhang Jie

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Truncated fragment of Cry1Ba3protein was extracted and purified.Bioassay against neonates ofOstriniafurnacaliswas conducted by feeding artificial diet with the truncated fragment of Cry1Ba3.The result showed truncated fragment of Cry1Ba3had a high toxicity againstO.furnacalis(LC50=5.29 μg/g，95% fiducial limit was between 3.96and 7.10μg/g).LC50of purified active fragment of Cry1Ac protein,with molecular weight of 60ku,was 0.83μg/g against neonates ofO.furnacalis.Then the BBMVs of the fifth instar larvae ofO.furnacaliswas extracted.Competitive binding experiment was conducted by using purified Cry1Ba3and Cry1Ac protein.The result showed Cry1Ba3and Cry1Ac had no competitive action in the process of binding to midgut ofO.furnacalis,indicating these two toxins may have different receptors on BBMVs ofO.furnacalis.

Cry1Ba3protein; Cry1Ac protein;Ostriniafurnacalis; competitive binding

2013-06-08

：2013-10-20

國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2009CB118902)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272115)

S 476.12

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.005

* 通信作者 Tel: 010-62815921； E-mail: jzhang@ippcaas.cn