香蕉分化芽BBTVDAS-ELISA檢測方法的建立和應(yīng)用

周 朋, 余乃通, 章紹延, 王健華,胡加誼, 王 祥, 梁 潔, 劉志昕

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室, ?？?571101；2. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院, ?？?570228)

香蕉分化芽BBTVDAS-ELISA檢測方法的建立和應(yīng)用

周 朋1,2, 余乃通1*, 章紹延1, 王健華1,胡加誼1, 王 祥1, 梁 潔1, 劉志昕1*

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室, ?？?571101；2. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院, ?？?570228)

為了解海南?？谙憬斗只繑y帶香蕉束頂病毒(Bananabunchytopvirus, BBTV)的情況,本研究建立了雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)(DAS-ELISA)檢測法,對來自海南地區(qū)組培廠的香蕉分化芽進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果表明,6個品種1 852個香蕉分化芽平均帶毒率為2.1%,其中‘皇帝蕉’為1.98%,‘粵科1號’為2.07%,‘廣粉蕉’為1.98%,‘大蕉’為6.25%,‘218’為1.89%,‘巴西蕉’為2.25%。為了進(jìn)一步驗證ELISA結(jié)果的可靠性,隨機(jī)選取12個陽性樣品提取總DNA進(jìn)行PCR鑒定。鑒定結(jié)果顯示,12個樣品中11個檢測出有BBTV,表明DAS-ELISA方法的準(zhǔn)確率較高,與分子檢測結(jié)果基本一致,可以勝任日常香蕉組培苗BBTV的檢測。

香蕉束頂病毒； DAS-ELISA； 病毒檢測

香蕉(Musaspp.)屬于芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(MusaLinn.),是我國熱帶亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。香蕉種植業(yè)在中國海南是優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一,同時在該省種植香蕉具有區(qū)位、氣候和土地資源等客觀優(yōu)勢。但是,BBTV引起的香蕉束頂病威脅著世界1/4香蕉產(chǎn)區(qū)的生產(chǎn),且在我國海南地區(qū)病情較重,是海南香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素之一。受感染的香蕉會發(fā)育不良,逐漸萎縮,產(chǎn)生畸形果或無果,嚴(yán)重影響香蕉的產(chǎn)量[1-3]。近年來,無病毒組培苗的推廣使得香蕉上束頂病的發(fā)生大大減少,所以組培廠香蕉分化芽的病毒檢測在無毒苗生產(chǎn)中尤為重要。目前,國內(nèi)外BBTV的檢測方法主要有分子方法和血清學(xué)方法,Peng等[4]最近還報道了loop-mediated isothermal amplification(LAMP)檢測技術(shù),其中血清學(xué)方法操作簡單,成本低,適合大量樣品的檢測[5]。

研究香蕉不同品種分化芽帶毒率差異與田間病毒病發(fā)生之間的關(guān)系,對香蕉田間生產(chǎn)具有非常重大的指導(dǎo)意義。胡漢橋[6]對廣東不同品種香蕉分化芽的香蕉線條病毒(Bananastreakvirus, BSV)和BBTV帶毒情況進(jìn)行了PCR檢測,結(jié)果表明粉蕉上BSV發(fā)病最嚴(yán)重,其他品種發(fā)病率也在10%～52%；而PCR未檢測到BBTV感染。目前,海南地區(qū)尚未報道不同品種之間BBTV的帶毒情況。本研究利用DAS-ELISA法針對海南地區(qū)6個不同品種的香蕉分化芽進(jìn)行BBTV帶毒率檢測,同時利用PCR技術(shù)對DAS-ELISA結(jié)果進(jìn)行抽檢,驗證了結(jié)果的可靠性。本試驗為進(jìn)一步監(jiān)控BBTV的流行情況和研究不同品種的抗病性提供了重要依據(jù),同時為海南省香蕉大規(guī)模種植生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣品

香蕉分化芽來自海南香蕉組培廠,陽性對照是經(jīng)PCR檢測確定感染BBTV的香蕉葉片,陰性對照為健康香蕉苗。

1.1.2 試劑和引物序列

DAS-ELISA試劑盒購自美國Agdia公司(SRA 24700/0500)；植物基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司(目錄號：DP305)；EasyTaqDNA Polymerase購自北京全式金技術(shù)有限公司；BBTV的引物序列根據(jù)GenBank中BBTV DNA1組分(HQ378190、HQ616074)的保守序列設(shè)計BBTV DNA1 F(5′ATGTGGTATGCTGGATGTTC3′)/BBTV DNA1 R(5′GTTCATATTTCCCGCTTTGA3′),退火溫度為55 ℃。

1.2 方法

1.2.1 DAS-ELISA法檢測BBTV

DAS-ELISA按照美國Agdia公司ELISA說明書操作,顯色后,用酶標(biāo)儀測定A405的吸光值。

1.2.2 DAS-ELISA法效價測試

將原核表達(dá)的BBTV CP融合蛋白作為免疫原,以1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1 024 000、1∶2 048 000倍稀釋為12個梯度,初始濃度為2 μg/mL。按照美國Agdia公司ELISA說明書操作,顯色后,用酶標(biāo)儀測定A405的吸光值。

1.2.3 香蕉分化芽總DNA提取

取香蕉分化芽,用液氮研磨后稱取100 mg樣品,按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取病樣總DNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR反應(yīng)體系及程序

BBTV檢測的PCR擴(kuò)增體系按照北京全式金技術(shù)有限公司EasyTaqDNA Polymerase說明書設(shè)計,反應(yīng)體系為提取的總DNA模板0.02 mg,10×Buffer(含Mg2+)2 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,EasyTaqDNA Polymerase(5 U/mL) 0.2 μL,10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL,用滅菌的ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35個循環(huán)；72 ℃ 10 min,16 ℃保存。反應(yīng)后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗血清效價測試

試驗結(jié)果表明,當(dāng)抗體稀釋到1∶64 000倍時與空白對照數(shù)值一致。而1∶1 000稀釋的抗體檢測結(jié)果是1∶64 000稀釋倍數(shù)(或水對照)檢測數(shù)值的2.5倍(圖1),分析表明Agdia公司制備的抗血清能用于檢測香蕉分化芽。但是由于苗芽的生長時間較短,病毒積累量較低等原因,判定陽性和陰性的比值有所調(diào)整,以A405(樣品)為A405(健康對照)的1.5倍及以上即判定為陽性,并用PCR等分子檢測方法驗證其結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 抗血清效價測定

2.2 不同香蕉樣品的DAS-ELISA檢測

經(jīng)DAS-ELISA法對1 852個樣品的檢測,結(jié)果表明,‘大蕉’、‘皇帝蕉’、‘粵科1號’、‘廣粉蕉’、‘218’和‘巴西蕉’共檢出陽性樣品39個(表1),BBTV的平均檢出率為2.1%,其中‘大蕉’檢出率最高,為6.25%；354個‘皇帝蕉’檢出率為1.98%；531個‘粵科1號’檢出率為2.07%；252個‘廣粉蕉’檢出率為1.98%；211個‘218’檢出率為1.89%,488個‘巴西蕉’檢出率為2.25%(表2)。

2.3 PCR驗證

從DAS-ELISA法檢測為陽性的樣品中隨機(jī)挑取12個,試劑盒提取其總DNA,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果條帶清晰,質(zhì)量較好。PCR法結(jié)果顯示12個樣品中的11個均擴(kuò)增到一條大小約為1 100 bp的帶(圖2)。該結(jié)果證明DAS-ELISA法檢測香蕉分化芽中BBTV的準(zhǔn)確率較高,與PCR分子檢測的結(jié)果基本一致,可以勝任日常香蕉分化芽中BBTV的大規(guī)模檢測。

表11852個香蕉分化芽中檢測到的39個陽性樣品

Table1Thirty-ninepositivesamplesdetectedfrom1852bananadifferentiatedshootswerebyDNA-ELISA

編號SamplenameA405樣品Sample陽性對照CK+陰性對照CK-編號SamplenameA405樣品Sample陽性對照CK+陰性對照CK-編號SamplenameA405樣品Sample陽性對照CK+陰性對照CK-S60．2020．1950．106K40．4300．5320．170P180．1520．1510．077S700．2060．1950．106K140．4080．5320．170P210．1230．1510．077S710．2070．1950．106L370．3310．4550．129P380．1220．1510．077T450．1510．1600．720L490．3220．4550．129N430．1200．1510．077T990．1930．1600．067H900．1590．1320．072R10．1520．1610．068V280．1850．1400．062M680．3960．6320．138R120．190．1610．068V560．1760．1400．062D110．5241．0450．263R220．1630．1610．068V740．1810．1400．062F680．1200．1390．075U200．1580．1610．068U900．2210．1400．062G361．1520．1270．061N160．1630．1520．078V790．1020．1090．059G490．1230．1270．061N540．1660．1520．078W860．3080．1800．116F580．1450．1270．061N640．1730．1520．078I60．2650．1800．116D40．1430．1320．070N670．1820．1520．078J210．4010．5320．017P170．1520．1510．077H50．2080．1320．072

表2不同品種香蕉分化芽帶BBTV情況

Table2BBTV-carryingrateamongthe6bananavarieties

樣品材料Material基因型Genotype檢測總數(shù)/個Totalnumber陽性株數(shù)/個Positivenumber檢出率/%Positiverate皇帝蕉HuangdibananaAA35471．98廣粉蕉GuangfenbananaABB25251．98大蕉MusasapientumABB1616．25粵科1號YuekeNo．1AAA531112．07218AAA21141．89巴西蕉BrazilbananaAAA488112．25

圖2 PCR鑒定12個ELISA陽性樣品

3 結(jié)論與討論

BBTV株系繁多[7],且不同株系對寄主的感染情況也不同,何自福等[8]分離的BBTV高州分離物不能侵染粉蕉,而天河分離物卻可以侵染粉蕉。DAS-ELISA結(jié)果表明海南‘大蕉’的BBTV檢出率最高,達(dá)到6.25%,其他香蕉品種的檢出率均在2%左右,表明海南BBTV株系更易侵染‘大蕉’,該推斷有待進(jìn)一步驗證。

本試驗以A405(樣品)/A405(健康對照)大于等于1.5倍判定為陽性，主要基于以下3點原因：1)用于本試驗的ELISA的多克隆抗血清是直接利用提純的BBTV病毒粒子免疫家兔產(chǎn)生的,它對各BBTV株系靈敏程度也不一樣,會對檢測造成一定的誤差[9]；2)本次檢測是由不同人分批次完成的,所用陽性樣品也不同,顯色時間控制不夠嚴(yán)格；3)香蕉體內(nèi)BBTV病毒含量極低。這些因素使得本次檢測的結(jié)果不夠穩(wěn)定。故本試驗對DAS-ELISA方法判定陽性和陰性的A405比值有所調(diào)整。

BBTV的寄主范圍較窄,主要通過香蕉交脈蚜(Pentalonianigronervosa)以持久方式傳播,周仲駒等[10]接種測定結(jié)果表明,‘香蕉’、‘粉芭蕉’和‘大蕉’等是香蕉束頂病毒的主要寄主。所以種植無病蕉苗、及時鏟除病株和防治香蕉交脈蚜是減少香蕉束頂病(Banana bunchy top disease, BBTD)病害發(fā)生的3個主要手段。本研究香蕉幼苗DAS-ELISA檢測方法的建立,對香蕉田間生產(chǎn)具有非常重大的指導(dǎo)意義。

另外,黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)和香蕉線條病毒(Bananastreakvirus, BSV)也是引起我國香蕉病毒病的重要病毒,在檢測分化芽BBTV時還要同時檢測這兩種病毒,才能做到真正的無毒苗,將香蕉病毒病造成的損失降到最小[11]。

[1]Chen Y, Hu X. High-throughput detection ofBananabunchytopvirusin banana plants and aphids using real-time TaqMan(R) PCR[J]. Journal of Virological Methods, 2013, 193(1): 177-183.

[2]Bressan A, Watanabe S. Immunofluorescence localisation ofBananabunchytopvirus(Family Nanoviridae) within the aphid vector,Pentalonianigronervosa, suggests a virus tropism distinct from aphid-transmitted luteoviruses[J]. Virus Research, 2011, 155(2): 520-525.

[3]Elayabalan S, Kalaiponmani K, Subramaniam S, et al. Development ofAgrobacterium-mediated transformation of highly valued hill banana cultivar Virupakshi (AAB) for resistance to BBTV disease[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 29(4): 589-596.

[4]Peng J, Zhang J F, Xia Z H, et al. Rapid and sensitive detection ofBananabunchytopvirusby loop-mediated isothermal amplification[J]. Journal of Virological Methods, 2012, 185(2): 254-258.

[5]李華平, 胡晉生, 范懷忠. 香蕉花葉病檢測技術(shù)的比較[J].病毒學(xué)報, 1997, 13(3): 273-277.

[6]胡漢橋,李信申,梁甲賢,等.不同基因型香蕉分化芽BSV和BBTB帶毒率的PCR檢測[J].植物保護(hù)學(xué)報,2010,37(1):95-96.

[7]Yu N T, Zhang Y L, Feng T C. et al. Cloning and sequence analysis of twoBananabunchytopvirusgenomes in Hainan[J].Virus Genes, 2012, 44(3): 488-494.

[8]何自福.香蕉束頂病毒株系鑒定及衣殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)[J]. 植物病理學(xué)報, 2000, 30(3): 287-288.

[9]余乃通,馮團(tuán)誠,王健華,等.香蕉束頂病毒?？诜蛛x物 CP 基因的原核表達(dá)、純化及其抗血清制備[J].熱帶作物學(xué)報, 2010, 31(5): 767-771.

[10]周仲駒,徐平東,陳啟建,等.香蕉束頂病毒的寄主及其在病害流行中的作用[J]. 植物病理學(xué)報, 1998, 28(1): 67-71.

[11]饒雪琴, 張曙光, 高喬婉.工廠化組培香蕉分化芽中病毒的檢測[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005, 26(1): 64-66.

EstablishmentandapplicationofDAS-ELISAmethodfordetectionof
Bananabunchytopvirusinbananadifferentiatedshoots

Zhou Peng1,2, Yu Naitong1, Zhang Shaoyan1, Wang Jianhua1,Hu Jiayi1, Wang Xiang1, Liang Jie1, Liu Zhixin1

(1.KeyLaboratoryofBiologyandGeneticResourcesofTropicalCrops,MinistryofAgriculture,InstituteofTropical
BioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalScience,Haikou571101,China;2.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou570228,China)

In order to understand the situation ofBananabunchytopvirus(BBTV) infection in banana differentiated shoots in Hainan, 1 852 shoot samples from 6 banana varieties were detected by DAS-ELISA method. The results showed that the average BBTV-carrying rate was 2.1%, while 1.98% of ‘Huangdi’ banana, 2.07% of ‘Yueke No.1’ banana, 1.98% of ‘Guangfen’ banana, 6.25% ofMusasapientum, 1.89% of ‘218’ banana, and 2.25% of ‘Brazil’ banana, respectively. To further confirm the accuracy of DAS-ELISA result, 12 BBTV-carrying samples were selected for molecular detection by PCR. The results showed that 11 of them were BBTV positive, indicating DAS-ELISA method with the high accuracy can be used for BBTV detection in banana differentiated shoots.

Bananabunchytopvirus； DAS-ELISA； virus detection

2013-10-09

：2014-04-18

國家自然科學(xué)基金項目(31070131)；海南省重大科技項目子課題(ZDZX2013023-1)；2012年度海南省研究生創(chuàng)新科研課題(Hys2012-15)

S 432.41

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.021

* 通信作者 E-mail:yunaitong@163.com； liuzhixin@itbb.org.cn