三種PCR方法檢測柑橘黃龍病菌的效果比較

程保平, 彭埃天, 宋曉兵, 凌金鋒, 陳 霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所;廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640)

實驗方法與技術

三種PCR方法檢測柑橘黃龍病菌的效果比較

程保平, 彭埃天*, 宋曉兵, 凌金鋒, 陳 霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所;廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640)

為了比較常規(guī)PCR、巢式PCR和實時熒光定量PCR方法在大田檢測中對柑橘黃龍病(Huanglongbing, HLB)的檢測效果,首先比較了3種檢測方法對柑橘黃龍病菌檢測的靈敏度,結果發(fā)現(xiàn)：3種檢測方法的靈敏度依次為常規(guī)PCR<巢式PCR<實時熒光定量PCR。運用3種檢測方法對廣東5個柑橘品種上的189個黃龍病疑似病樣進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)：黃龍病檢出率依次為常規(guī)PCR<巢式PCR<實時熒光定量PCR。研究表明：常規(guī)PCR適合以較低成本大規(guī)模檢測黃龍病；實時熒光定量PCR具有最大的檢測靈敏度；巢式PCR檢測技術同時具有前兩者的一些優(yōu)點,但操作較復雜,適合技術熟練的研究者使用。

柑橘黃龍病; 常規(guī)PCR; 巢式PCR; 實時熒光定量PCR; 比較研究

柑橘黃龍病是世界柑橘生產(chǎn)上最為嚴重的病害,在我國及東南亞、非洲、阿拉伯半島、印度、巴西和美國佛羅里達和加利福尼亞等國家和地區(qū)均有發(fā)生,嚴重制約著世界柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。

柑橘黃龍病的病原被認為是韌皮部桿菌屬,有亞洲種、非洲種和美洲種3個種[2-3]。目前在我國傳播的是亞洲種[4]。該病菌主要由接穗、苗木和木虱傳播,還可通過菟絲子在柑橘間傳播。植株感病后,傳病速度快,目前尚無有效藥劑和抗病品種,因此及時準確地診斷有助于及早清除傳染源,對于防止病害的快速傳播具有重要意義[5]。

柑橘黃龍病有一些典型的癥狀。初期癥狀：葉脈腫突,枝梢變黃,中質硬化、無光澤。中后期癥狀：病葉陸續(xù)脫落,病梢萌發(fā)早、短而纖弱,病葉細狹長、硬化、出現(xiàn)均勻黃化或斑駁癥狀,果實出現(xiàn)“紅鼻子果”癥狀。最后植株根部腐爛,生長逐漸衰弱,以致整株死亡[6-7]。但該病的癥狀與缺素、病毒病等有相似的癥狀,而且癥狀診斷帶有很多主觀因素,因此診斷準確率不高[8]。

20 世紀90 年代后,隨著分子生物學方法的發(fā)展,大量準確靈敏的分子檢測方法已用于該病的檢測[9]。目前最廣泛用于黃龍病菌檢測的是PCR方法[10]。1996年Jagoueix等依據(jù)黃龍病菌核糖體蛋白基因設計了特異引物,應用常規(guī)PCR 檢測柑橘黃龍病菌[11]。2007 年Zhou 等為提高檢測靈敏度,運用巢式PCR檢測黃龍病菌[12]。同樣基于該菌的核糖體蛋白基因,2006 年Wang 等建立實時熒光定量PCR方法來檢測黃龍病菌[13]。本研究綜合比較了這3種檢測方法對廣東柑橘黃龍病菌的檢測靈敏度與田間檢測率。

1 材料與方法

1.1 樣品與材料

3種PCR檢測所用的黃龍病疑似樣品分別采自廣東省的龍門、肇慶、云浮等地的柑橘基地,共189個樣品。陰性對照樣品為本研究室種植于防蟲網(wǎng)內(nèi)的健康柑橘葉片,陽性對照為種植于防蟲網(wǎng)內(nèi)的感染黃龍病柑橘植株的葉片。用于特異性檢測的病原菌為本研究室保存于PDF培養(yǎng)基上的柑橘潰瘍病菌、柑橘炭疽病菌、辣椒疫霉菌(可危害柑橘)、保存于防蟲網(wǎng)室內(nèi)柑橘上的柑橘衰退病病毒和柑橘碎葉病病毒。用于靈敏度測試的重組質粒為插入柑橘黃龍病菌16S rDNA的pMD19重組質粒，由本研究室構建。

1.2 檢測葉片樣品處理

田間采集葉片置于塑封袋,再保存于冰盒內(nèi)。制樣時清洗并晾干柑橘葉片,然后剪取葉片中脈放入滅菌研缽,加入液氮研磨成粉狀,最后按愛思進公司試劑盒說明書提取樣品總基因組。質粒提取方法同樣參照愛思進公司的試劑盒說明書。在3種檢測方法的靈敏度試驗中,將重組質粒DNA原液10倍梯度稀釋為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5等系列稀釋液,然后作為PCR的模板。以本研究室保存于防蟲網(wǎng)室內(nèi)的健株柑橘葉脈DNA為陰性對照,以保存于防蟲網(wǎng)內(nèi)的感染黃龍病的柑橘葉片為陽性對照。

1.3 PCR 引物

常規(guī)PCR：上游引物OI1：5′-GCGCGTATGC-AATACGAGCGGCA-3′,下游引物OI2c：5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′[11]。巢式PCR 引物對：外側引物為OI1/OI2c; 內(nèi)側引物的上游引物CGO3F：5′-RGGGAAAGATTTTATTGGAG-3′,下游引物對CGO5R: 5′-GAAAATAYCATCT-CTGATATCGT-3′[12]。SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR引物對上游引物CQULA04F: 5′-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA-3′,下游引物CQULA04R：5′-CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA-3′[13],引物對均由廣州英駿公司合成。PCR 緩沖液、Taq酶、SYBR Premix ExTaq等購自大連寶生物公司。質粒DNA提取試劑盒和基因組DNA提取試劑盒等購自愛思進公司。使用儀器為：iCyclerTMABI 7500型實時熒光定量PCR,Molecular Imager Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)。

1.4 PCR檢測體系及擴增程序

50 μL 反應體系,包括 PremixTaq25 μL、10 μmol/L 的引物各2 μL,DNA 模板1 μL,補水至50 μL。擴增反應程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min[11]。

1.5 巢式PCR 檢測

采用常規(guī)PCR中的OI1/OI2c為巢式PCR外側引物進行第1輪的PCR擴增,反應體系以及反應程序參照常規(guī)PCR反應。取1 μL第1輪PCR反應產(chǎn)物為模板,以CGO3F/CGO5R為內(nèi)側引物進行第2輪PCR擴增,反應體系與常規(guī)PCR相同。反應程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45s,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增完成后將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳[12]。

1.6 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測

20 μL 的反應體系,包括SYBR Premix ExTaq緩沖液10 μL、10 μmol /L 引物對各0.8 μL、模板1 μL、ROX-Dye2 0.4 μL、補水至20 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,45個循環(huán);72 ℃延伸5 min[13]。PCR 擴增結束后進行熔解曲線分析,用于驗證擴增的特異性。

2 結果與分析

2.1 常規(guī)PCR、巢式PCR 的檢測靈敏度

通過對濃度稀釋梯度為10-1～10-9的重組質粒DNA樣品的檢測發(fā)現(xiàn)：常規(guī)PCR和巢式PCR檢測方法均可快速、特異、靈敏地檢測出黃龍病菌的16S rDNA片段,常規(guī)PCR可在濃度梯度為10-1～10-5的5個重組質粒DNA稀釋樣品中檢測出清晰的目標條帶,其中對10-5稀釋的樣品檢測中發(fā)現(xiàn)：凝膠電泳條帶非常微弱(圖1)。而巢式PCR檢測結果顯示：10-5稀釋的樣品中仍可檢測到清晰的目標條帶，10-6～10-8稀釋的DNA中亦能檢測到條帶。10-9稀釋模板后進行檢測,無清晰的擴增條帶出現(xiàn)。表明巢式PCR方法的檢測靈敏度是普通PCR檢測方法的1 000倍(圖2)。

圖1 常規(guī)PCR在柑橘黃龍病菌檢測中的靈敏度測試

圖2 巢式PCR在柑橘黃龍病菌檢測中的靈敏度測試

2.2 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測靈敏度

通過對濃度稀釋梯度為10-2～10-9的重組質粒DNA樣品的檢測發(fā)現(xiàn)：實時熒光定量PCR可在濃度梯度10-2～10-9的重組質粒DNA模板中采集到陽性信號(圖3)。反應呈現(xiàn)良好的線性關系。

圖3 實時熒光定量PCR在柑橘黃龍病菌檢測中的靈敏度測試

2.3 三種方法的檢測特異性驗證

為驗證本文常規(guī)PCR、巢式PCR和實時熒光定量PCR(q-PCR)方法對柑橘黃龍病檢測的特異性,運用3種檢測方法對本研究室保存的柑橘潰瘍病菌、柑橘炭疽病菌、辣椒疫霉菌(可危害柑橘)、柑橘衰退病病毒、柑橘碎葉病病毒及健康柑橘對照樣品進行檢測,結果均無陽性反應；而3種檢測方法對感染黃龍病的柑橘樣品均可檢出陽性反應(表1)。

表1三種PCR檢測技術對柑橘黃龍病菌的檢測特異性驗證
Table1SpecificitytestofthethreemoleculardetectionmethodsforHLB

樣品類型Samplestype樣品數(shù)/個Samplesnumbers普通PCR檢出數(shù)/個DetectednumbersinconventionalPCR巢式PCR檢出數(shù)/個DetectednumbersinnestedPCR實時熒光定量PCR檢出數(shù)/個Detectednumbersinq?PCR健康柑橘Healthycitrus6000柑橘炭疽病菌Citrusanthracnosepathogen6000辣椒疫霉菌Phytophthorapathogen6000柑橘衰退病Citrustristezadiseasesamples6000柑橘碎葉病Citrustatterleafvirussamples6000柑橘潰瘍病Citruscankerpathogen6000黃龍病罹病樣CitrusinfectedbyHLB6666

2.4 疑似黃龍病柑橘樣品的實際檢測

在廣東龍門、肇慶、云浮等地多個柑橘品種上采集疑似黃龍病的斑駁黃化葉片,取葉脈提取DNA,使用常規(guī)PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR 3種檢測方法進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)：3種檢測方法對田間的189個樣品的檢測結果不同,陽性樣品檢出數(shù)分別為：111、141、152,檢出率分別為58.7%、74.6%、80.4%。其檢測效果為：常規(guī)PCR<巢式PCR<實時熒光定量PCR(表2)。

表23種PCR檢測技術對廣東柑橘黃龍病疑似樣品與多種柑橘病原菌的實際檢測結果
Table2DetectionofHLB-infectedsamplescollectedfromGuangdongbythethreemoleculardetectionmethods

來源地Origin樣品Samples樣品數(shù)/個Samplesnumbers普通PCR檢出數(shù)/個DetectednumbersinconventionalPCR巢式PCR檢出數(shù)/個DetectednumbersinnestedPCR實時熒光定量PCR檢出數(shù)/個Detectednumbersinq?PCR龍門Longmen年橘Nianju23577砂糖橘Shatangju43283136肇慶Zhaoqing砂糖橘Shatangju26172123貢柑Gonggan47294143云浮Yunfu砂糖橘Shatangju157911臍橙Qicheng25172222陽春Yangchun春甜橘Chuntianju1081010本研究室Ourlab健康柑橘Negativecontrol6000黃龍病罹病樣Positivecontrol6666

3 結論與討論

柑橘黃龍病樹有一些典型的癥狀,人們常以此來判斷黃龍病的發(fā)生。但癥狀診斷帶有很多主觀因素,且該病的癥狀與柑橘缺素癥、柑橘病毒病等有很多相似之處,因此診斷準確率不高[6]。人們還開發(fā)出了一些其他診斷方法,如：指示植物鑒定法、組織染色觀察法、電鏡切片觀察法、核酸雜交檢測法等,但這些方法或者檢測時間長、操作復雜,或者檢測靈敏度不夠,難以直接應用于黃龍病的田間實際檢測[8]。

PCR 技術具有快速、靈敏、準確等優(yōu)點, 已成為當前柑橘黃龍病檢測的主要手段。PCR技術主要有：普通PCR、巢式PCR與實時熒光定量PCR[5]。這3種檢測方法對廣東省各種柑橘品種的田間檢測效果還缺少評價和報道。

本研究首先對比了3種PCR方法對柑橘黃龍病菌的檢測靈敏度。試驗表明：普通PCR、巢式PCR、實時定量熒光PCR方法均可對黃龍病菌16S rDNA進行有效檢測,但其檢測靈敏度有所不同,依次為：常規(guī)PCR<巢式PCR <實時熒光定量PCR。在模板定量研究中發(fā)現(xiàn)：實時熒光定量PCR的靈敏度是巢式PCR的10倍,而巢式PCR的靈敏度是普通PCR的1 000倍。

與實驗室的理想條件不同,田間檢測樣品中混雜了很多柑橘基因組和一些可能干擾PCR反應的抑制物[14]。對采自田間不同柑橘品種的樣品進行檢測后發(fā)現(xiàn)：3種檢測方法可有效抵御抑制物對PCR反應的影響,均可順利地在田間樣品中檢測出黃龍病菌。3 種PCR檢測技術對本研究室保存的柑橘潰瘍病菌、柑橘炭疽病菌、辣椒疫霉菌、柑橘衰退病病毒、柑橘碎葉病病毒及健康柑橘對照樣品均無陽性反應,說明這3種檢測方法的特異性較好。研究還發(fā)現(xiàn)：這3種檢測方法的田間檢測效果是：常規(guī)PCR<巢式PCR <實時熒光定量PCR。再次表明：田間條件下,實時熒光定量PCR對黃龍病菌仍有最高的檢測靈敏度,而普通PCR由于其靈敏度的限制,可能會在大規(guī)模檢測中出現(xiàn)一些漏檢,但其檢測成本遠低于實時熒光定量PCR,適合田間大規(guī)模檢測應用。巢式PCR同時具有前兩者的一些優(yōu)點,而其檢測成本和田間檢測效果介于普通PCR和實時熒光定量PCR之間,但考慮到其實驗操作較為繁瑣,且容易因開管操作形成濺射氣溶膠而造成樣品污染,因此認為該方法更適合技術熟練者使用[15]。

綜上,普通PCR得益于其較低的成本,適合用于大規(guī)模的田間初次普查檢測；實時熒光定量PCR非常適合對普通PCR沒有檢出的疑似樣品進行進一步的確認,或可對黃龍病菌侵染早期,含菌量較低的樣本,如種苗、接穗進行定量檢測；巢式PCR同時具有前兩者的一些優(yōu)點,但由于對操作的要求較高,適合經(jīng)驗較為豐富的研究人員開展試驗,且在試驗中需嚴格遵守試驗程序,確保試驗用品的消毒,并嚴格控制樣品污染,從而避免假陽性。

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Comparisonofcitrushuanglongbingmoleculardetectionmethods

Cheng Baoping, Peng Aitian, Song Xiaobing, Ling Jinfeng, Chen Xia

(PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou510640,China)

Detection sensitivity and detection rate of conventional PCR, nested PCR and real-time quantitative PCR were compared for detection of citrus huanglongbing. The results showed that the detection sensitivity was ranked from high to low as real-time quantitative PCR>nested PCR>conventional PCR. Then total 189 suspected citrus samples from five different cultivars with symptom of HLB in orchard of Guangdong were amplified and confirmed by the three methods. The results indicated that the detection rate was ranked from high to low as real-time quantitative PCR>nested PCR>conventional PCR. This research indicated that conventional PCR, du to its low cost, could be used in large scale diagnosis of HLB disease, real-time quantitative PCR had the highest detection sensitivity, and nested-PCR had the advantages of the other two, but its experimental operation was more complex.

CandidatusLiberibacter asiaticus; conventional PCR; nested-PCR; real time quantitative PCR; comparative research

2013-11-18

：2014-02-09

廣東省農(nóng)業(yè)科技推廣專項資金重大技術研究項目(201201127);廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(粵農(nóng)[2009]380號);廣東省農(nóng)業(yè)科學院院長基金項目(201305);科技創(chuàng)新人才出國培養(yǎng)計劃(粵農(nóng)科[2013]74號)

S 412

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.019

* 通信作者 E-mail：pengait@163.com