油菜田看麥娘對(duì)精喹禾靈的抗性水平及抗性機(jī)理研究

祝瑋瑋， 劉藝嫵， 劉祥英， 羅 坤， 柏連陽(yáng),2*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所， 長(zhǎng)沙 410128; 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410128)

油菜田看麥娘對(duì)精喹禾靈的抗性水平及抗性機(jī)理研究

?，|瑋1， 劉藝嫵1， 劉祥英1， 羅 坤1， 柏連陽(yáng)1,2*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所， 長(zhǎng)沙 410128; 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410128)

采用培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法和盆栽法測(cè)定了湖南省境內(nèi)長(zhǎng)沙市、永州市、常德市、益陽(yáng)市、瀏陽(yáng)市、岳陽(yáng)市、婁底市7個(gè)市州10個(gè)地區(qū)油菜田看麥娘潛在抗藥性種群對(duì)精喹禾靈的抗性水平，測(cè)定了常德市桃源地區(qū)看麥娘潛在抗藥性種群以及敏感種群谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)對(duì)精喹禾靈的敏感性，對(duì)桃源地區(qū)看麥娘抗性品系及敏感品系A(chǔ)CCase基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，比較了兩種生物型的基因序列。培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法測(cè)定結(jié)果表明：常德市桃源地區(qū)看麥娘抗藥性生物型對(duì)精喹禾靈的抗性水平最高，抗性倍數(shù)為10.50倍，其他地區(qū)看麥娘抗性倍數(shù)在2.01～7.09倍之間，抗性水平不明顯；盆栽法測(cè)定結(jié)果表明：桃源地區(qū)看麥娘抗性倍數(shù)最高，為25.30倍，其他地區(qū)看麥娘抗性倍數(shù)在2.43～9.47倍之間，尚未產(chǎn)生明顯抗藥性。經(jīng)精喹禾靈處理后，看麥娘抗藥性生物型的GSTs活力在第5天明顯高于敏感生物型，表明GSTs的活性是引起看麥娘對(duì)精喹禾靈抗性的重要因子。通過(guò)靶標(biāo)基因片段擴(kuò)增與DNA測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，抗藥性生物型氨基酸序列第93位比敏感生物型多出一個(gè)丙氨酸，抗藥性的產(chǎn)生與靶標(biāo)基因的突變是否相關(guān)需要進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

油菜田； 看麥娘； 精喹禾靈； 抗藥性

看麥娘(AlopecurusaequalisSobol.)為我國(guó)常見田間惡性雜草，屬禾本科(Poaceae)禾亞科(Agrostidoideae)看麥娘屬(Alopecurus)，多危害小麥、油菜等夏收作物[1-2]。目前用于防治油菜田看麥娘的莖葉處理劑以乙酰輔酶A羧化酶ACCase抑制劑類為主，其主要包括兩大類：芳氧苯氧丙酸類AOPP和環(huán)己烯酮類CHD。ACCase抑制劑類除草劑主要是抑制乙酰輔酶A羧化成丙二酰輔酶A，導(dǎo)致植物內(nèi)部的脂肪酸無(wú)法合成，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)而達(dá)到破壞植物代謝使其快速死亡的效果[3-4]。

由于ACCase抑制劑對(duì)雙子葉植物的高度安全和對(duì)禾本科雜草的高效抑制，因此被廣泛用于油菜田、小麥田等田間雜草的防除[5]。長(zhǎng)期以來(lái)頻繁和廣泛使用除草劑使得油菜田雜草抗藥性問題頻發(fā)。2001年Heap就報(bào)道已有11種抗性生物型雜草在油菜田發(fā)現(xiàn)，其中最嚴(yán)重的是對(duì)ACCase抑制劑產(chǎn)生抗性的野燕麥和狗尾草[6]。我國(guó)最早對(duì)油菜田雜草看麥娘抗藥性進(jìn)行報(bào)道的是黃世霞，其通過(guò)培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法研究發(fā)現(xiàn)部分油菜田看麥娘已對(duì)高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生抗性[7]。王信群研究結(jié)果表明油菜田看麥娘已對(duì)高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生一定抗性，同時(shí)對(duì)精喹禾靈產(chǎn)生交互抗性，但對(duì)環(huán)己烯酮類的快捕凈無(wú)交互抗性[8]。

雜草對(duì)除草劑產(chǎn)生抗藥性主要有三大原因[9-10]：一是作用靶標(biāo)的改變；二是代謝作用的加強(qiáng)；三是除草作用的屏蔽。部分抗ACCase抑制劑類除草劑的雜草通過(guò)改變修飾體內(nèi)的ACCase來(lái)達(dá)到降低對(duì)除草劑敏感性的效果，如Brown[11]等研究發(fā)現(xiàn)，ACCase的異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼釋?dǎo)致看麥娘對(duì)環(huán)己烯酮類除草劑烯禾啶產(chǎn)生抗性；Délye[12]等報(bào)道，ACCase在1 781位將異亮氨酸編碼成亮氨酸的突變是看麥娘抗芳氧苯氧基丙酸類除草劑的主要原因。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一個(gè)同工酶家族，其可受多種因素誘導(dǎo)，對(duì)一些有毒物質(zhì)，包括農(nóng)藥、除草劑、致癌物和誘變劑等起到解毒作用[13]，郇志博[14]研究黑龍江省大豆田稗草對(duì)精喹禾靈的抗性機(jī)理發(fā)現(xiàn)，低水平抗性與GSTs活動(dòng)增強(qiáng)相關(guān)。

油菜田看麥娘對(duì)ACCase抑制劑產(chǎn)生抗性的問題已在部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，但目前湖南省境內(nèi)仍未見相關(guān)研究報(bào)道，鑒于此，筆者從湖南省內(nèi)7個(gè)市10個(gè)地區(qū)的油菜田采集到了11個(gè)看麥娘潛在抗藥性生物型，并從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得了相應(yīng)的敏感生物型(未使用過(guò)除草劑)，運(yùn)用培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法和盆栽法測(cè)定了其對(duì)精喹禾靈的抗性水平，測(cè)定了常德市桃源地區(qū)看麥娘潛在抗藥性生物型以及由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的看麥娘敏感生物型谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，并通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)與DNA測(cè)序比對(duì)研究其抗藥性產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)，為科學(xué)合理使用該藥提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藥劑： 94%精喹禾靈原藥，京博農(nóng)化科技有限公司；15.8%精喹禾靈乳油，上海艾科思生物藥業(yè)有限公司。

主要試劑：硝酸鉀、無(wú)水乙醇、丙酮、吐溫-80，天津恒興化學(xué)試劑有限公司；PVP40，Sigma公司；Tris、L-還原型谷胱甘肽，Ameco公司；考馬斯亮藍(lán)、蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，南京建成生物工程研究所；Plant Genomic DNA Kit(離心柱型)，TIANGEN公司；10×EasyTaq buffer、dNTP mixture、EasyTaq DNAPloymerase，Trans公司；巰基乙醇、氯仿、Tris平衡酚，Solarbio公司。

主要儀器：智能型人工氣候箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；WM-2天然氣壓縮機(jī)，天津儀器；Allegra X-22R 離心機(jī)，BECKMAN COULTER； 5804R離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；UV-1240紫外分光光度計(jì)，島津公司；PCR擴(kuò)增儀，Applied Biosystems公司；DYY-6 c型電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)，培清科技。

雜草種子：于2013年4-5月在湖南省7個(gè)市10個(gè)地區(qū)油菜田采集看麥娘潛在抗藥性生物型，敏感種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院雜草研究室提供，采集地點(diǎn)與用藥歷史見表1。

表1看麥娘采集地點(diǎn)與精喹禾靈用藥歷史

Table1ThecollectingsitesofAlopecurusaequalisandthebackgroundofquizalofop-P-ethyl

采樣地點(diǎn)Collectingsite精喹禾靈應(yīng)用歷史Backgroundofquizalofop?P?ethyl長(zhǎng)沙Changsha長(zhǎng)沙縣榔梨鎮(zhèn)約5年芙蓉區(qū)東岸鄉(xiāng)約2年常德Changde安鄉(xiāng)縣深柳鎮(zhèn)約8年鼎城區(qū)石門橋鎮(zhèn)約5年桃源縣陬市鎮(zhèn)約8年漢壽縣五豐村約2年益陽(yáng)Yiyang南縣浪拔湖鎮(zhèn)約2年瀏陽(yáng)Liuyang瀏陽(yáng)市向陽(yáng)村約3年岳陽(yáng)Yueyang平江縣長(zhǎng)壽鎮(zhèn)約4年婁底Loudi雙峰鎖石鎮(zhèn)約4年永州Yongzhou祁陽(yáng)縣石鼓源鄉(xiāng)約5年南京Nanjing南京農(nóng)業(yè)大學(xué)未使用除草劑

1.2 方法

1.2.1 看麥娘的抗藥性測(cè)定

采用培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法和盆栽法測(cè)定看麥娘對(duì)精喹禾靈的抗性水平[15]。培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法：稱取53.19 mg的94%精喹禾靈原粉，先用少量丙酮溶解后再用0.1%的吐溫-80水溶液稀釋成系列質(zhì)量濃度藥液，供試。

在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行劑量反應(yīng)試驗(yàn)?？贷溎锓N子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的硝酸鉀(KNO3)于4 ℃冰箱中低溫處理72 h后，繼續(xù)用去離子水培養(yǎng)至露白，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的種子各40粒分別置于含有5 mL不同質(zhì)量濃度藥液和鋪有兩張濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋確保種子處于濕潤(rùn)狀態(tài)。精喹禾靈的有效成分含量分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/L，以去離子水處理作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)4次。培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為白天24 ℃，晚上18 ℃，每天光照12 h。處理7 d后測(cè)量芽長(zhǎng)，計(jì)算抑制率，求出回歸方程。所有數(shù)據(jù)使用DPS軟件處理。

盆栽法：稱取0.03 mL的15.8%精喹禾靈乳油，用去離子水稀釋成系列質(zhì)量濃度藥液，供試。

在直徑為9 cm的塑料盆缽內(nèi)，裝入風(fēng)干、過(guò)篩并與營(yíng)養(yǎng)土混合后的土壤。每盆播種經(jīng)0.2%硝酸鉀處理72 h后培養(yǎng)至露白的看麥娘種子20粒。置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為白天24 ℃，晚上18 ℃，每天光照12 h。出苗后，每盆定苗10株，待看麥娘長(zhǎng)至3～4葉期進(jìn)行莖葉噴霧，噴液量為450 L/hm2。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)設(shè)定精喹禾靈的有效處理劑量為236.88、118.44、59.22、29.61、14.81和7.40 g/hm2，以去離子水溶液處理作為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)。于噴藥后21 d剪取看麥娘地上部分，稱鮮重，計(jì)算各處理的鮮重抑制率，使用DPS軟件求出回歸方程。

1.2.2 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活性測(cè)定[16]

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的提?。河谑┯镁天`后1～8 d取樣。取看麥娘地上部分0.5 g，剪碎放入預(yù)冷的研缽中，加入5 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0，含還原型谷胱甘肽25 mmol/L，5%PVP)，冰浴勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為酶提取液，以上操作均在-4 ℃條件下進(jìn)行。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活性測(cè)定：于3 mL Tris-HCL緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0)中加入0.1 mL酶液，25 ℃保溫10 min，加入0.1 mL無(wú)水乙醇配制的13 mmol/L CDNB，反應(yīng)10 min 后，于 340 nm 處測(cè)得A值。以 1 mg/L 蛋白 10 min 催化反應(yīng)使吸光值改變 0.001為一個(gè)酶活力單位，以1 mg/L可溶性蛋白的酶活力單位數(shù)為酶活力。以施藥酶活力與空白對(duì)照酶活力的比值為相對(duì)活力。各處理重復(fù)3次，使用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.3 ACCase的作用位點(diǎn)PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序及序列分析

選取南京農(nóng)業(yè)大學(xué)敏感品系和常德市桃源地區(qū)潛在抗性品系看麥娘作為供試材料，培養(yǎng)方法同盆栽法，出芽后每盆移種看麥娘20株，出苗后，每盆定苗16株，待各株看麥娘長(zhǎng)至3～4葉期即使用Plant Genomic DNA Kit提取DNA。參考黃世霞[17]合成本試驗(yàn)引物(表2)，用于擴(kuò)增ACCase的CT區(qū)序列。

表2本試驗(yàn)中所用引物1)

Table2Theprimersusedinthisstudy

引物名稱Primername引物序列Primersequence目的區(qū)域PositionACVRG15′CTGCAAACATTGGTG?GACCTCTTCCTATTAC3′5816～6872ACVRG1R5′CAGTCGGTGCTTCCTGC?TGCAGCTG3′

1) 目的區(qū)域指位于大穗看麥娘(Alopecurusmyosuroides)基因序列(GenBank No.AJ310767)中的位置。

PCR擴(kuò)增體系包含：Template 2.4 μL，Primer ACVRG1、ACVRG1R各1 μL，10×EasyTaq Buffer 1 μL，dNTP Mixture和EasyTaq(5U/μL)各1 μL，Sterile Ultra-pure Water 36.6 μL。擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 10 min；94 ℃ 45 s，63 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物回收、測(cè)序均由博尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果由生物軟件Vector NTI進(jìn)行比對(duì)分析。同源性比對(duì)在基因數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI中進(jìn)行BLAST分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 看麥娘對(duì)精喹禾靈的抗性水平

通過(guò)培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法測(cè)定看麥娘的抗藥性水平(表3)結(jié)果表明，與敏感株系相比，常德桃源采集點(diǎn)的看麥娘對(duì)精喹禾靈的抗性水平最高，其抗性倍數(shù)為10.50倍，EC50為2.246 mg/L。其他采集點(diǎn)的抗性倍數(shù)在2.01～7.09之間，抗性水平不明顯。

表3培養(yǎng)皿法測(cè)定不同看麥娘生物型對(duì)精喹禾靈的抗藥性水平

Table3TheresistancelevelsofdifferentAlopecurusaequalisbiotypestoquizalofop-P-ethyldeterminedbyseedbioassayexperiments

地點(diǎn)Site生物型Biotype回歸方程(y=)Regressionequation相關(guān)系數(shù)CorrelationcoefficientEC50(95%置信區(qū)間)/mg·L-1抗藥性指數(shù)Resistanceindex(RI)南京NanjingNJ5．1831+0．2739x0．96590．214(0．060～0．337)1長(zhǎng)沙ChangshaCS14．9627+1．4947x0．98691．059(0．431～1．663)4．95CS25．4063+1．8161x0．98560．597(0．273～0．938) 2．79常德安鄉(xiāng)Anxiang，ChangdeAX4．8619+1．0503x0．95041．354(0．191～2．126)6．33常德桃源Taoyuan，ChangdeTY4．6459+1．0075x0．96682．246(0．134～3．528)10．50 常德鼎城Dingcheng，ChangdeDC4．9992+0．8442x0．97431．002(0．147～1．574)4．68常德漢壽Hanshou，ChangdeHS5．1393+0．8533x0．97300．687(0．079～1．078)3．21瀏陽(yáng)LiuyangLY5．1422+0．9571x0．97390．710(0．140～1．115)3．32永州YongzhouYZ4．8070+1．0649x0．97151．518(0．165～2．384)7．09岳陽(yáng)YueyangYU5．0363+0．4882x0．97420．843(0．017～1．323)3．94婁底LoudiLD5．0025+0．8517x0．96170．993(0．121～1．560)4．64益陽(yáng)YiyangYY5．1942+0．5131x0．95260．418(0．006～0．657)2．01

盆栽法結(jié)果(表4)表明，常德桃源采集點(diǎn)的看麥娘對(duì)精喹禾靈的抗性水平較高，其抗性倍數(shù)為25.30倍，EC50為81.801 g/hm2，其他采集點(diǎn)的抗性倍數(shù)在2.43～9.47倍，尚未產(chǎn)生明顯抗性。

表4整株法測(cè)定不同看麥娘生物型對(duì)精喹禾靈的抗藥性水平

Table4TheresistancelevelsofdifferentAlopecurusaequalisbiotypestoquizalofop-P-ethylbywhole-plantbioassay

地點(diǎn)Site生物型Biotype回歸方程(y=)Regressionequation相關(guān)系數(shù)CorrelationcoefficientEC50(95%置信區(qū)間)/g·hm-2抗藥性指數(shù)Resistanceindex(RI)南京NanjingNJ4．2605+1．4400x0．96983．262(0．001～5．123)1長(zhǎng)沙ChangshaCS12．0724+2．3700x0．985017．190(4．521～26．994)5．27CS23．2962+1．7920x0．95128．929(0．733～14．022)2．74常德安鄉(xiāng)Anxiang，ChangdeAX2．6334+1．7358x0．994523．091(0．533～36．262)7．08常德桃源Taoyuan，ChangdeTY4．4674+0．2785x0．972281．801(0．001～128．458)25．30常德鼎城Dingcheng，ChangdeDC1．9851+2．4640x0．973816．734(5．360～26．278)5．13常德漢壽Hanshou，ChangdeHS2．5616+2．1910x0．979512．971(2．689～20．369)3．98瀏陽(yáng)LiuyangLY2．0763+2．4608x0．964715．421(5．321～24．216)4．73永州YongzhouYZ2．3097+1．8060x0．994630．877(0．292～48．489)9．47岳陽(yáng)YueyangYU2．0995+2．5800x0．956813．311(4．131～20．903)4．08婁底LoudiLD2．5331+1．8856x0．991020．338(4．819～31．938)6．23益陽(yáng)YiyangYY2．3849+2．9103x0．99367．917(0．602～12．433)2．43

2.2 精喹禾靈對(duì)抗性和敏感生物型看麥娘GSTs活力的影響

經(jīng)精喹禾靈處理后，抗藥性生物型看麥娘的GSTs活力即開始上升，至第5天達(dá)到最高值，為同期對(duì)照的1.27倍，隨后GSTs活力開始下降，至第8天回落至同期對(duì)照水平；敏感生物型看麥娘GSTs活力在施藥后開始下降，至第3天開始回升，第6天達(dá)到最高水平，為同期對(duì)照的1.12倍，第7天基本回落至對(duì)照水平，第8天降至對(duì)照水平以下。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，抗藥性生物型GSTs活力在第5天顯著高于敏感生物型GSTs活力，第1～4天及第6～8天兩者并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(圖1)。

圖1 精喹禾靈對(duì)看麥娘GSTs的影響

2.3 ACCase作用位點(diǎn)的序列分析

利用引物ACVRG1、ACVRG1R進(jìn)行擴(kuò)增，得到南農(nóng)敏感生物型和桃源抗藥性生物型看麥娘ACCase基因CT區(qū)的部分序列,擴(kuò)增片段大小約為1 053 bp。在基因數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI中經(jīng)BLAST分析比較，發(fā)現(xiàn)該序列與大穗看麥娘ACCase基因(GenBank No. AJ310767)序列同源性達(dá)90%，確定該擴(kuò)增序列為看麥娘的ACCase基因部分序列。將擴(kuò)增所得抗性及敏感生物型看麥娘氨基酸序列用Vector NTI11.5比對(duì)發(fā)現(xiàn)，抗藥性生物型氨基酸序列在第93位比敏感生物型多一個(gè)丙氨酸(圖2)。

圖2 抗性及敏感生物型看麥娘靶標(biāo)位點(diǎn)氨基酸序列比較(用引物ACVRG1、ACVRG1R擴(kuò)增所得)

3 討論

本研究采用培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法和盆栽法測(cè)定了湖南省境內(nèi)7個(gè)市10個(gè)地區(qū)采集點(diǎn)看麥娘對(duì)精喹禾靈的抗藥性水平，兩種測(cè)定方法結(jié)果均顯示常德市桃源地區(qū)的抗性水平達(dá)到中等程度，其他地區(qū)采集點(diǎn)看麥娘對(duì)精喹禾靈尚未產(chǎn)生明顯抗性，這一結(jié)果可能與桃源地區(qū)用藥時(shí)間長(zhǎng)于其他地區(qū)有關(guān)。明確各地油菜田看麥娘對(duì)精喹禾靈的抗藥性水平，對(duì)制定化學(xué)防除方案及合理施用藥劑有重要意義。此外，本研究中盆栽法抗性倍數(shù)普遍高于培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法抗性倍數(shù)，其原因可能是培養(yǎng)皿法是在雜草幼苗期施藥，而溫室栽培法是在雜草3～5葉期施藥，隨著雜草自身的生長(zhǎng)，其解毒代謝能力不斷增強(qiáng)，故后者的抗性倍數(shù)要高于前者。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一類重要的解毒酶，它可以催化谷胱甘肽與多種疏水化合物的親電子基團(tuán)相連接，這種連接方式是生物體進(jìn)行脫毒和排毒的重要方式[18]。研究結(jié)果顯示，桃源地區(qū)看麥娘GSTs活力在第5天顯著高于敏感品系看麥娘，表明其對(duì)精喹禾靈產(chǎn)生中等抗藥性的原因之一為其代謝酶GSTs代謝能力的增強(qiáng)，這與其他相關(guān)禾本科雜草對(duì)ACCase抑制劑產(chǎn)生抗藥性的研究結(jié)論基本一致[19-20]。Li Lingxu[21]等研究發(fā)現(xiàn)，第1 781位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼崾菍?dǎo)致麥田罔草對(duì)精惡唑禾草靈產(chǎn)生抗藥性的主要原因；Tang Huaiwu[22]等報(bào)道，日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生抗藥性主要可能是由4個(gè)核苷酸突變導(dǎo)致的，包括甘氨酸取代1 734位精氨酸，絲氨酸取代1 739位蘇氨酸，亮氨酸取代1 738位蛋氨酸，以及天冬酰胺取代2 041位異亮氨酸；湯懷武[23]報(bào)道，抗性和敏感生物型日本看麥娘ACCase基因序列存在11處差異。本研究結(jié)果顯示，抗藥性生物型植株的氨基酸序列在第93位比敏感生物型多一個(gè)丙氨酸，但考慮到抗藥性生物型與敏感生物型來(lái)自不同生態(tài)區(qū)，遺傳背景可能不同，因此其氨基酸序列的突變是由于其遺傳背景不同導(dǎo)致還是抗性水平差異造成仍需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)從精喹禾靈對(duì)看麥娘GSTs活性影響和靶標(biāo)位點(diǎn)基因的改變兩個(gè)角度來(lái)闡述抗性產(chǎn)生的機(jī)理，但抗性的產(chǎn)生是否涉及其他酶系的作用以及相關(guān)靶標(biāo)基因表達(dá)量的改變還有待進(jìn)一步研究。

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ResistancelevelofAlopecurusaequalistoquizalofop-P-ethylinrapeinHunanProvince

Zhu Weiwei1, Liu Yiwu1, Liu Xiangying1, Luo Kun1, Bai Lianyang1, 2

(1.InstituteofPesticides,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China;2.HunanAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410128,China)

In order to investigate the resistance level and mechanism ofAlopecurusaequalisSobol. to quizalofop-P-ethyl in rape, 10 potential resistant biotypes were collected from 7 cities in Hunan Province and the susceptible biotype was obtained from Nanjing Agricultural University. The resistance level ofA.aequalisto quizalofop-P-ethyl was assessed by two methods: seed bioassay and whole-plant bioassay. The enzymology mechanism of Taoyuan Town potential resistant biotype and Nanjing Agricultural University susceptible biotype was studied with the important metabolic enzyme glutathione-s-transferase(GSTs), and the resistance mechanism at the molecular level was detected by using PCR technology and comparing the amino acid sequences of resistant and sensitive plants. The results of seed bioassay showed that the relative resistance factor of Taoyuan Town in Changde was 10.50, which was the highest. The resistance factor of all of the other potential resistant biotypes ranged from 2.01 to 7.09, which was sensitive to quizalofop-P-ethyl. The results of whole-plant bioassay showed that the relative resistance factor of the biotype from Taoyuan Town in Changde was 25.30, while the factors of other potential resistant biotypes were from 2.43 to 9.47. The GST activity of resistant biotypes was obviously higher than that of the susceptible biotype on the fifth day, indicating that the difference in the metabolic ability of GSTs to quizalofop-P-ethyl was an important reason for the resistance to quizalofop-P-ethyl. The comparison of ACCase sequences between the resistant and sensitive biotypes showed that the amino acid sequence of resistant biotype had one additional Ala, but further verification is needed to figure out the relationships between resistance level and target gene’s mutation.

rape field;Alopecurusaequalis; quizalofop-P-ethyl; herbicide resistance

2014-01-08

：2014-03-25

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303031)

S 481.4

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.014

* 通信作者 E-mail: bailianyang2005@aliyun.com