基于mtDNA-COⅠ的云南西花薊馬的遺傳分析

沈登榮， 宋文菲， 袁盛勇， 田學(xué)軍， 和紹禹， 張宏瑞

(1. 紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 蒙自 661100; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 昆明 650201;3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所， 蒙自 661101; 4. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所， 昆明 650201)

基于mtDNA-COⅠ的云南西花薊馬的遺傳分析

沈登榮1,2， 宋文菲3， 袁盛勇1， 田學(xué)軍1， 和紹禹4， 張宏瑞2*

(1. 紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 蒙自 661100; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 昆明 650201;3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所， 蒙自 661101; 4. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所， 昆明 650201)

西花薊馬是我國(guó)重要的入侵害蟲(chóng)之一，為了解其不同地理種群的遺傳分化，測(cè)定了云南6個(gè)地理種群141個(gè)個(gè)體的mtDNA-COⅠ基因片段。結(jié)果表明：在比對(duì)的433 bp基因片段中，變異位點(diǎn)19個(gè)，共檢測(cè)出5個(gè)共享單倍型，單倍型間出現(xiàn)了明顯的遺傳分化，證實(shí)了云南西花薊馬為一個(gè)復(fù)合種群。地理種群間的遺傳距離較低，遺傳距離與地理距離無(wú)顯著相關(guān)性。各地理種群西花薊馬的遺傳分化指數(shù)Fst為-0.021 19，種群間變異多為負(fù)值，表明云南西花薊馬種群遺傳變異主要來(lái)自于種群內(nèi)部，種群間未發(fā)生明顯的遺傳分化。

西花薊馬； mtDNA-COⅠ； 遺傳分化； 復(fù)合種群

西花薊馬[Frankliniellaoccidentalis(Pergande)]是一種世界性的農(nóng)業(yè)和園藝害蟲(chóng)，具有雜食性的特點(diǎn)，寄主植物多達(dá)60多科500余種，主要以茄科、葫蘆科、豆科等作物受害最為嚴(yán)重[1-2]。該蟲(chóng)除取食植物的莖、葉、花、果外，還傳播番茄斑萎病毒等多種病毒[3]。目前，西花薊馬主要在北美洲、歐洲、亞洲等地區(qū)廣泛分布[1,4]，在我國(guó)主要分布于北京、云南、浙江、山東等省市[5-8]。我國(guó)于2003年首次在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)西花薊馬[5]，而在2000年昆明國(guó)際花卉節(jié)上，曾在參展的緬甸盆景上截獲過(guò)西花薊馬[9]，結(jié)合西花薊馬目前在云南的分布情況，表明云南是我國(guó)西花薊馬入侵較早的地區(qū)之一。此外，云南境內(nèi)獨(dú)特的立體氣候?yàn)檠芯课骰ㄋE馬的種群遺傳分化提供了有利的自然條件。

近年來(lái)，mtDNA分子標(biāo)記被廣泛用于纓翅目未知薊馬種類(lèi)的鑒定[10-14]。此外，mtDNA-COⅠ基因還用于發(fā)現(xiàn)隱存種和研究種內(nèi)分化，通過(guò)分析種群遺傳分化水平，對(duì)入侵薊馬的來(lái)源地進(jìn)行推測(cè)[15-17]。目前國(guó)內(nèi)有游中華[12]、武曉云等[18]、Yang等[19]對(duì)我國(guó)西花薊馬的入侵來(lái)源、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化進(jìn)行了研究，Yang等[19]的研究表明云南3個(gè)種群(大理、保山、昆明)的遺傳多樣性高于我國(guó)其他地區(qū)。鑒于云南是我國(guó)西花薊馬分布較廣的地區(qū)之一，本研究采用mtDNA-COⅠ基因作為分子標(biāo)記，從分子遺傳學(xué)的角度剖析云南不同地理種群西花薊馬的種內(nèi)遺傳及種群遺傳分化，為進(jìn)一步了解西花薊馬在我國(guó)的擴(kuò)散及定殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

西花薊馬的采集地點(diǎn)包括10個(gè)地州市，劃分為6個(gè)地理種群，即：滇西種群(DX)、滇中種群(DZ)、滇南種群(DN)、滇西南種群(DXN)、滇西北種群(DXB)、滇東北種群(DDB)。西花薊馬的樣本信息見(jiàn)表1，標(biāo)本用95%乙醇浸泡，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1不同地理種群西花薊馬樣本信息

Table1SampleinformationofdifferentgeographicpopulationsofF.occidentalis

種群代碼Populationcode寄主Hostplant經(jīng)度Longitude緯度Latitude海拔高度/mAltitude采集時(shí)間/年?月Collectiondate樣本數(shù)Samplesize滇西DX保山Baoshan茼蒿Chrysanthemumcoronarium、紅千層Callistemonrigidus、石竹Dianthuschinensis、茄子Solanummelongena99°14′25°13′16382009?0525大理Dali酢漿草Oxaliscorniculata、辣椒Capsi?cumannuum、韭菜Alliumtuberosum、扶桑Hibiscusschizopetalus100°07′25°41′19762010?06滇中DZ昆明Kunming三葉草Trifoliumrepens、洋蔥Alliumce?pa、馬蹄蓮Zantedeschiaaethiopica、菊花Dendranthemamorifolium102°47′24°53′18952010?0425楚雄Chuxiong曼陀羅Daturastramonium、月季Rosachinensis、油菜Brassicacampestris101°61′25°36′17732009?04滇南DN紅河Honghe大蒜Alliumsativum、洋蔥Alliumcepa、辣椒C．a(chǎn)nnuum、茄子S．melongena、月季R．chinensis103°24′23°30′13072010?0424玉溪Yuxi茄子S．melongena、四季豆Phaseolusvulgaris、三葉草T．repens、旱金蓮Tro?paeolummajus102°32′24°34′16302010?04滇西南DXN臨滄Lincang南瓜Cucurbitamoschata、四季豆P．vul?garis、辣椒C．a(chǎn)nnuum、洋蔥A．cepa、大蒜A．sativum100°05′23°51′15152008?1022普洱Puer洋蔥A．cepa、大蒜A．sativum、三葉草T．repens、番茄Lycopersiconesculentum、辣椒C．a(chǎn)nnuum100°59′22°45′13452009?04滇西北DXB麗江Lijiang三葉草T．repens、蒲公英Taraxacumof?ficinale、繡球花Hydrangeaserrata、青菜Brassicachinensis100°03′27°11′18102009?0423滇東北DDB昭通Zhaotong茴香Foeniculumvulgare、向日葵Heli?anthusannuus、番茄L．esculentum、辣椒C．a(chǎn)nnuum103°42′27°19′19812010?0622

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組總DNA的提取

參照張利娟等[20]的薊馬基因組DNA的提取方法，采用微針戳刺薊馬腹部節(jié)間膜來(lái)提取薊馬基因組DNA。盡量保存蟲(chóng)體的外部形態(tài)，以便對(duì)薊馬的種類(lèi)進(jìn)行鑒定。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

擴(kuò)增引物為mtD 7.2F：5′-ATTAGGAGCHCCHGAYATAGCATT-3′；mtD 9.2R：5′-CAGGCAAGATTAAAATATAAACTTCTG-3′。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，體系包括：2 μL DNA模板、5 μL 10×Buffer(MgC121.5 mmol/L)、4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.5 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)(大連寶生物，TaKaRa)，上下游引物各1.0 μL(10 pmol/μL)，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR步驟如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸l min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，目的片段的測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 序列處理和數(shù)據(jù)分析

采用DnaSP 5.0統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)目及出現(xiàn)頻率。利用MEGA 4.0軟件分析核苷酸堿基組成、堿基的變異突變位點(diǎn)。選用 Kimura 2-Parameter模型，采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)[21]。應(yīng)用Arlequin v3.01軟件計(jì)算群體間的分化指數(shù)(Fst)和進(jìn)行分子方差分析[22]。采用Mantel test分析遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，地理距離根據(jù)兩地的經(jīng)緯度計(jì)算。采用Network4.0 程序構(gòu)建單倍型的中介網(wǎng)絡(luò)圖[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA-COⅠ序列變異及遺傳多態(tài)性

測(cè)定的mtDNA-COⅠ基因片段長(zhǎng)度為433 bp，其中保守位點(diǎn)414個(gè)，變異位點(diǎn)19個(gè)，無(wú)插入/缺失位點(diǎn)；變異位點(diǎn)數(shù)占總序列的4.39%，A+T含量(67.90%)明顯高于G+C含量(32.10%)，表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚性。轉(zhuǎn)換與顛換(R)比值為1.44。共檢測(cè)出5個(gè)共享單倍型(GenBank登錄號(hào)：JF719595～JF719599)，未發(fā)現(xiàn)獨(dú)有單倍型。

2.2 單倍型間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

基于mtDNA-COⅠ對(duì)各單倍型進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)中介圖的構(gòu)建(圖1)。從圖中可以看出：H3處于分支擴(kuò)展網(wǎng)絡(luò)中介圖的中心，為主體單倍型，出現(xiàn)頻率為53次。其中，H5與主體單倍型H3通過(guò)16步突變相連，而其余3個(gè)單倍型與主體單倍型H3僅為1步突變，顯示H5和H1～H4間已達(dá)到顯著的遺傳分化，表明云南西花薊馬種群為復(fù)合種群。

圖1 西花薊馬各單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖

為進(jìn)一步研究云南西花薊馬種群種內(nèi)遺傳關(guān)系，以梳缺花薊馬(F.schultzei)作為外群，加入GenBank中公布的部分西花薊馬mtDNA-COⅠ的序列(登錄號(hào)：EF469245～EF469250、AF378685～AF378688)，構(gòu)建mtDNA-COⅠ單倍型的NJ系統(tǒng)樹(shù)(圖2)。表明各單倍型明顯聚為兩個(gè)分支(分支支持率達(dá)到98%、99%)，即溫室品系(greenhouse strain)和羽扇豆品系(lupin strain)。圖中H1～H5為本研究所得到的單倍型(黑色三角表示)，其中H1～H4屬于溫室品系，H5屬于羽扇豆品系。從單倍型的出現(xiàn)頻率看出云南西花薊馬主要以溫室品系為主，占所有樣品的96.82%，而羽扇豆品系的比例僅為3.18%。

圖2 單倍型間的NJ系統(tǒng)樹(shù)

2.3 不同地理種群的遺傳距離

采用種群間的遺傳距離構(gòu)建西花薊馬的UPGMA聚類(lèi)圖(圖3)，各地理種群間的遺傳距離在0.003 6～0.006 7之間， DX(滇西)和DDB(滇東北)2個(gè)地理種群遺傳關(guān)系較為接近(0.003 6)，而DZ(滇中)種群與其余5個(gè)地理種群的遺傳距離較遠(yuǎn)。對(duì)遺傳距離與地理距離的Mantel相關(guān)性進(jìn)行檢測(cè)，表明種群間的遺傳距離與地理距離無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.259，P=0.351)。

圖3 西花薊馬種群的UPGMA聚類(lèi)圖

2.4 不同地理種群的遺傳分化

Arlequin v3.01分析結(jié)果顯示，各地理種群間的遺傳分化指數(shù)為-0.034 17～0.011 48之間(表2)，成對(duì)種群間的遺傳分化指數(shù)Fst多為負(fù)值或極低，表明各群體間未出現(xiàn)遺傳分化。對(duì)各種群間進(jìn)行AMOVA分析(表3)，結(jié)果顯示：6個(gè)地理種群間的遺傳分化指數(shù)Fst為-0.021 19，種群間變異為負(fù)值(-0.021 16)，說(shuō)明云南西花薊馬的遺傳變異主要來(lái)自于種群內(nèi)部，種群間還未發(fā)生明顯的遺傳分化現(xiàn)象。

表2西花薊馬種群間的遺傳分化指數(shù)

Table2TheFstvalueamongpopulationsofF.occidentalis

滇西DX滇中DZ滇南DN滇西南DXN滇西北DXB滇東北DDB滇西DX滇中DZ0．01148滇南DN-0．01348-0．02215滇西南DXN-0．01314-0．030320．00798滇西北DXB-0．02416-0．03102-0．041010．00830滇東北DDB-0．034170．011930．01319-0．01205-0．02426

表3西花薊馬種群間的分子方差分析

Table3AnalysisofmolecularvarianceamongF.occidentalispopulations

變異來(lái)源Sourceofvariation自由度df平方和Sumofsquare變異組成Variancecomponent變異比例/%Percentagevariation種群間55．018-0．02116-2．44種群內(nèi)135130．7900．88973102．44總變異140135．8090．86857遺傳分化指數(shù)Fst：-0．02119

3 討論

西花薊馬是一種世界性的農(nóng)業(yè)和園藝害蟲(chóng)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)分子標(biāo)記和抗藥性的差別，將西花薊馬劃分為溫室品系和羽扇豆品系[17]。本研究結(jié)果證實(shí)了入侵云南的西花薊馬為一個(gè)復(fù)合種群，內(nèi)部存在溫室品系和羽扇豆品系的分化，這與Rugman-Jones[17]、武曉云等[18]、Yang等[19]研究的結(jié)果基本一致。本次研究發(fā)現(xiàn)的羽扇豆品系分布于不同的地理種群，表明該品系已在云南建立了自然種群。此外，該系在早期被認(rèn)為是單食性昆蟲(chóng)，Rugman-Jones等報(bào)道了其他寄主，認(rèn)為其并非是單食性昆蟲(chóng)[17]，本次研究也發(fā)現(xiàn)其新的寄主，分別為繡球花、洋薊、油菜、三葉草。

遺傳多樣性不僅是形成生物多樣性的基礎(chǔ)，也是物種進(jìn)化潛能的保證，遺傳多樣性的下降，可能導(dǎo)致物種對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的降低[24]。Yang等[19]的研究也證實(shí)我國(guó)西花薊馬的遺傳多樣性較低，這與本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的種群間的核酸多態(tài)性(Pi)較低的結(jié)果一致?？赡苡梢韵略蛞穑?1)作為一種外來(lái)入侵害蟲(chóng)，西花薊馬在云南擴(kuò)散的時(shí)間還相對(duì)較短。(2)西花薊馬遠(yuǎn)距離擴(kuò)散主要依靠人為因素。地區(qū)間種苗、花卉的頻繁調(diào)運(yùn)給種群間提供了充分的基因交流，制約了種群間的遺傳分化。(3)種群遺傳多樣性較低，可能預(yù)示著入侵中國(guó)的西花薊馬經(jīng)歷過(guò)“瓶頸效應(yīng)”。(4)本研究取樣的地點(diǎn)相對(duì)集中，可能會(huì)對(duì)種群的單倍型種類(lèi)和數(shù)目有一定的影響。沈登榮等[25]的研究結(jié)果表明云南西花薊馬有過(guò)種群擴(kuò)張歷史，因此推測(cè)“瓶頸效應(yīng)”和種群擴(kuò)張是引起西花薊馬遺傳多樣性較低的主要原因。

此外，研究證實(shí)西花薊馬種內(nèi)存在顯著的遺傳分化，但云南各地理種群間還未出現(xiàn)遺傳分化，各單倍型在空間分布上沒(méi)有形成明顯的地理分布格局。Mantel test檢驗(yàn)也說(shuō)明地理隔離模型不能有效解釋目前各種群西花薊馬的分布格局。從西花薊馬在云南的分布可知，盡管其分布區(qū)域較廣，但主要分布區(qū)仍然集中在亞熱帶地區(qū)，溫度可能是影響其種群發(fā)展的重要因子，因此有必要對(duì)溫度和地理種群的遺傳分化進(jìn)行深入研究。

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GeneticanalysisofFrankliniellaoccidentalisbasedonmtDNA-COⅠinYunnan,China

Shen Dengrong1,2, Song Wenfei3, Yuan Shengyong1, Tian Xuejun1, He Shaoyu4, Zhang Hongrui2

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,HongheUniversity,Mengzi661100,China; 2.CollegeofPlantProtection,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 3.SericultureBeeResearchInstitute,YunnanAcademyofAgriculturalSciences,Mengzi661101,China; 4.EasternBeeResearchInstituteofYunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)

Frankliniellaoccidentalis(Pergande) is an important invasive pest in China. In order to understand the genetic differentiation among six geographical populations ofF.occidentalis, mtDNA-COⅠ sequences of 141 individuals were determined. The results showed that there were 19 variable sites in the 433-bp gene fragment. Five shared haplotypes were detected, and these haplotypes had an obvious genetic differentiation, which confirmed thatF.occidentaliswas a composite population in Yunnan. The genetic distance was low among populations, and there was no significant correlation between genetic distance and geographic distance. TheFstvalue was-0.021 19 among geographical populations, indicating that genetic variation was mainly derived from within the population, and the genetic differentiation among populations was not significant.

Frankliniellaoccidentalis; mtDNA-COⅠ; genetic differentiation; composite population

2013-11-05

：2014-02-10

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201103026，200803025)；云南省教育廳科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013Z148)；紅河學(xué)院植物保護(hù)碩士點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目；云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目

S 436.3

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.013

* 通信作者 E-mail: hongruizh@126.com