復合菌劑PS21對氧樂果脅迫下小麥幼苗生長及抗氧化酶的影響

葛紅蓮, 劉中華

(周口師范學院生命科學與農(nóng)學學院，周口 466001)

復合菌劑PS21對氧樂果脅迫下小麥幼苗生長及抗氧化酶的影響

葛紅蓮*, 劉中華

(周口師范學院生命科學與農(nóng)學學院，周口 466001)

采用溶液培養(yǎng)法研究了不同濃度的復合菌劑PS21與氧樂果協(xié)同處理對小麥幼苗生長及抗氧化酶的影響，初步探討復合菌劑PS21緩解氧樂果對小麥生長和抗氧化酶的抑制效應。研究結(jié)果表明，106～108cfu/mL濃度的復合菌劑PS21對氧樂果的毒害具有緩解作用，緩解作用與復合菌劑PS21濃度呈正相關性，菌液濃度為108cfu/mL時，緩解作用明顯，與氧樂果單獨處理相比，小麥株高、莖粗、干重、濕重、葉綠素含量顯著增加；在抗氧化酶系統(tǒng)中隨復合菌劑PS21濃度的升高，幼苗葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性均有不同程度的提高，丙二醛(MDA)含量下降。同濃度復合菌劑PS21的不同施用方法對氧樂果毒害的緩解作用存在差異，灌根法對氧樂果毒害小麥具有較強的緩解作用。

PS21復合菌劑； 氧樂果； 幼苗生長； 小麥； 抗氧化酶系

小麥是世界主要糧食作物，目前，小麥病蟲害的防治仍然以化學農(nóng)藥為主，氧樂果(omethoate),化學名稱為O，O-二甲基-S-甲基氨基甲酰甲基硫酐磷酸酯，作為防治小麥蚜蟲的骨干藥劑被長期大量使用[1]。大量氧樂果進入土壤后，被土壤中的有機質(zhì)所吸附，并溶于土壤孔隙的水中[2]，很大一部分農(nóng)藥殘留在土壤中，造成農(nóng)藥殘留的嚴重超標，對土壤生態(tài)環(huán)境造成污染，抑制小麥生長和降低小麥品質(zhì)[3-4]。近年來，有研究表明，過量施用氧樂果農(nóng)藥后，累積在小麥根系的氧樂果對小麥的生長存在影響，小麥幼苗的生長受到抑制，死苗率提高，對小麥產(chǎn)生一系列毒害作用，其機制是在氧樂果脅迫下小麥幼苗體內(nèi)產(chǎn)生了大量的自由基，這些自由基的積累破壞了小麥體內(nèi)正常的動態(tài)平衡，對小麥體內(nèi)葉綠素和類胡蘿卜素、抗氧化酶等物質(zhì)產(chǎn)生了嚴重的破壞作用[5-8]。另有研究表明高劑量的氧樂果將抑制小麥幼苗防御相關酶的活性，但隨時間的延長，抑制作用有所降低[7,9]。目前為止，未見報道增強作物對氧樂果損傷的防護作用的措施。

光合細菌是一類能進行不產(chǎn)氧光合作用的原核微生物，具有固碳、固氮、降解轉(zhuǎn)化有機物等生理特性，并且一些菌株還分泌抗病活性因子和生長激素[10-12]。光合細菌已經(jīng)作為生物菌肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛應用，可以提高幼苗葉綠素的含量，增強光合作用，促進植物根系的生長，起到促生壯苗的作用，同時光合細菌還具有抗病、防病效果[13-14]。近年來，有研究表明，一定濃度的光合細菌可以增強植物幼苗的抗逆性，利用光合細菌緩解重金屬、紫外線等脅迫對植物幼苗生長及抗氧化酶的影響，提高了植物幼苗的應激能力，促進植物生長[15-17]。但有關復合光合菌劑對氧樂果毒害作物是否有緩解作用，尚未見報道。本文以小麥為材料，研究不同濃度的復合菌劑和氧樂果復合處理對小麥的生長指標和抗氧化酶系的影響，為復合光合菌劑的進一步開發(fā)應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要培養(yǎng)基和試劑

光合細菌固體培養(yǎng)基采用基本培養(yǎng)基添加0.15%酵母膏[16]。

40%氧樂果乳油，河北新興化工有限公司生產(chǎn)。依據(jù)文獻[5]的研究結(jié)果，在5～10 g/L范圍內(nèi)，10 g/L的氧樂果對小麥的毒性效應最為顯著，本試驗所用氧樂果濃度為10 g/L。

1.2 供試菌株及小麥品種

小麥供試品種為‘周麥18’。光合細菌菌株AR12、AR13是從周口師范學院校園清水河水中經(jīng)富集、分離和純化獲得，經(jīng)初步鑒定分別為紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)。

1.3 復合光合菌劑的制備

將在冰箱內(nèi)保存的菌種AR12、AR13取出，用接種環(huán)挑取菌落至滅菌的光合細菌固體培養(yǎng)基表面進行菌種活化，經(jīng)30 ℃溫箱培養(yǎng)5 d后，加少量無菌水將菌苔洗下來制成菌懸液，用平板涂布法進行擴大培養(yǎng)，每菌株涂布10平皿，30 ℃溫箱培養(yǎng)3 d后，每平皿加等量無菌水將菌苔洗下制成菌懸液，2種菌按1∶1的比例復配成光合細菌復合菌劑PS21，菌液濃度分別為106、107、108cfu/mL，采用自動彩色菌落計數(shù)儀(美國DigiCounter V3)計數(shù)。

1.4 試驗設計

種子用0.1%HgC12消毒8 min，后用自來水充分沖洗，再用蒸餾水沖洗2～3次，然后將種子放到鋪有消毒濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加少量蒸餾水，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱在黑暗條件下催芽48 h。選取長勢一致的種子種在加有紗布的30 cm×20 cm×5 cm的托盤中，紗布上帶有100個人工剪孔，托盤中裝有2.5 L 1/2 Hoagland營養(yǎng)液，小麥放于孔中，根部朝下，在人工氣候室培養(yǎng)10 d后，加入40%氧樂果，濃度為10 g/L。試驗分A、B兩組，A組采用葉面噴施法，定期葉面噴施濃度為0、106、107、108cfu/mL的復合菌劑PS21，5 d噴施一次，每次復合菌劑施量為10 mL。B組采用灌根法，在小麥培養(yǎng)液中加入和A組同濃度的復合菌劑PS21。每處理設3個重復，每個重復5托盤苗，以1/2Hoagland營養(yǎng)液處理組的小麥幼苗作為對照。小麥幼苗置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，光照時間為12 h/d、晝夜溫度30/22 ℃、相對濕度70%，每5 d補一次營養(yǎng)液。在小麥幼苗期(處理10 d后)測定小麥形態(tài)指標，并取小麥植株同位葉的葉片測定生理生化指標。

1.5 小麥葉片生長指標及生理生化指標的測定

株高、根長采用皮尺測量；莖粗用游標卡尺測量；取小麥幼苗期植株(去根)，用電子天平稱量鮮重，然后烘干稱干重。

超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定采用NBT光化還原法，單位用U/mg表示[18]；CAT活性測定采用紫外吸收法，單位用U/(mg·min)表示[18]；POD活力的測定采用愈創(chuàng)木酚法測定，單位用U/mg表示[18]；采用丙酮和95%乙醇(V∶V為1∶1)浸提分光光度法測定葉綠素含量，單位為mg/g[19]；丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，單位為μmol/g[19]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧樂果對小麥幼苗生長的影響

氧樂果單獨處理小麥，對小麥的生長具顯著的抑制作用(表1)，與對照相比，小麥幼苗根長、株高、莖粗、干重和鮮重分別降低了26.46%、12.38%、14.75%、26.32%和50.0%。本試驗結(jié)果說明氧樂果對小麥幼苗有毒害作用，抑制小麥幼苗的生長。

表1氧樂果對小麥幼苗生長的影響1)

Table1Effectsofomethoateonthegrowthofwheatseedlings

處理Treatment根長/cmRootlength株高/cmPlantheight莖粗/cmStemdiameter鮮重/gFreshweight干重/gDryweight1/2Hoagland營養(yǎng)液+10g/L氧樂果1/2Hoaglandsolution+10g/Lomethoate(19．71±0．40)b(15．71±0．19)b(0．52±0．03)b(0．14±0．001)b(0．01±0．001)b1/2Hoagland營養(yǎng)液(對照)1/2Hoaglandsolution(CK)(26．80±0．60)a(17．93±0．44)a(0．61±0．05)a(0．19±0．001)a(0．02±0．002)a

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同列數(shù)據(jù)不同字母表示在0.05水平差異顯著。
Data in the table are mean±SE. Different lowercase letters in the same column indicate significant different at 0.05 level.

2.2 復合菌劑PS21與氧樂果復合處理對小麥幼苗生長的影響

由圖1、2可知，采用噴施法和灌根法施用復合菌劑PS21處理小麥幼苗，均能有效緩解氧樂果對小麥生長的抑制作用，緩解作用與復合菌劑濃度的升高呈正相關性，各處理間均存在顯著差異。菌液濃度為108cfu/mL，小麥幼苗各生長指標達到最高，與氧樂果單獨處理組相比，噴施法處理組小麥株高、莖粗、干重和鮮重分別提高了31.95%、21.15%、130.0%、45.18%，灌根法處理組小麥相應生長指標分別提高了60.98%、32.69%、180.0%、55.56%。采用不同方法施用復合菌劑對氧樂果毒害小麥的緩解能力不同，菌液為106～108cfu/mL時，灌根法處理組小麥幼苗株高、干重和鮮重比噴施法處理組相應值大，達到差異性顯著水平(P<0.05)；當菌液濃度<107cfu/mL，噴施法處理組小麥莖粗和灌根法處理組相應值差異性不顯著，菌液濃度為108cfu/mL時，兩處理相應值存在顯著差異(P<0.05)。復合菌劑和氧樂果復合處理小麥，氧樂果對小麥生長的抑制作用有所緩解，促進了小麥的生長。

圖1 不同濃度復合菌劑PS21與氧樂果復合處理對小麥幼苗株高和莖粗的影響

圖2 不同復合菌劑PS21與氧樂果復合處理對小麥幼苗鮮重和干重的影響

2.3 復合菌劑PS21與氧樂果復合處理對小麥幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素是光合作用的主要色素，參與植物的光合作用，其含量反映了葉片生理狀態(tài)。從圖3可以看出，氧樂果單獨處理組的小麥幼苗葉綠素含量下降，比對照組下降了35.49%。施用復合菌劑PS21后，小麥幼苗葉綠素含量隨著復合菌劑濃度的增大而增加，復合菌劑各處理組極顯著高于氧樂果單獨處理組(P<0.01)，菌液濃度為108cfu/mL時，小麥幼苗葉綠素含量達到最高，噴施法和灌根法處理組分別比氧樂果單獨處理組提高了108.94%、145.09%。復合菌劑不同施用方法對氧樂果毒害小麥幼苗的緩解程度不同，灌根法處理組中葉綠素含量比噴施法處理組中相應值大，且達顯著差異水平(P<0.05)。由此可表明，復合菌劑緩解了氧樂果對小麥葉綠素合成的傷害，且隨濃度的增加緩解作用增強。

圖3 不同復合菌劑PS21與氧樂果復合處理對小麥幼苗葉綠素含量的影響

2.4 復合菌劑PS21與氧樂果復合處理對小麥幼苗抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT和POD 3種酶具有清除植物體內(nèi)活性氧自由基、維持細胞膜穩(wěn)定性的功能。由圖4可知，氧樂果單獨處理小麥幼苗時，小麥葉片SOD、CAT和POD活性下降，與對照相比，分別下降83.01%、80.26%和70.16%，氧樂果顯著抑制了3種酶的活性。施用復合菌劑PS21后，小麥幼苗SOD、CAT和POD活性隨著復合菌劑濃度的升高而增加，且各處理間達到顯著差異水平(P<0.05)，菌液濃度為108cfu/mL時，小麥幼苗抗氧化酶活性達到最高，與氧樂果單獨處理組相比，噴施法處理組小麥幼苗SOD、CAT和POD活性分別提高了184.21%、320.0%、174.07%，灌根法處理組小麥相應酶活性分別提高了216.70%、380.0%、199.89%。由此表明，光合細菌可提高植物應激能力，緩解氧樂果對小麥造成的損傷。采用不同方法施用復合菌劑緩解氧樂果毒害小麥幼苗的程度不同，菌液為106～108cfu/mL時，灌根法處理組小麥幼苗SOD、CAT和POD活性比噴施法處理組相應值大，達到極顯著差異水平(P<0.01)。

圖4 不同濃度復合菌劑與氧樂果復合處理對小麥抗氧化酶活性的影響

2.5 復合菌劑PS21與氧樂果復合處理對小麥幼苗MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，其含量的高低是評定植物細胞膜受損害程度的指標之一。圖5顯示，氧樂果單獨處理組小麥幼苗的MDA含量顯著增加，比對照增加了476.37%。施用復合菌劑PS21后，小麥幼苗MDA含量隨著復合菌劑濃度的增大而降低，菌液濃度為108cfu/mL時，小麥幼苗MDA含量達到最低，噴施法和灌根法處理組MDA含量分別比氧樂果單獨處理組降低了43.93%、75.85%。復合菌劑不同施用方法緩解氧樂果對細胞膜破壞的程度不同，噴施法處理組中MDA含量比灌根法處理組中相應值大，且達差異顯著水平(P<0.01)。由此表明，復合菌劑緩解了氧樂果對小麥細胞的傷害，且隨濃度的增加緩解作用增強。

圖5 復合菌劑PS21與氧樂果復合處理對小麥幼苗MDA含量的影響

3 討論與結(jié)論

過量的氧樂果對小麥幼苗將造成傷害，傷害機理為在氧樂果脅迫下，小麥體內(nèi)自由基的積累會引起MDA含量的升高，膜脂過氧化，破壞了小麥體內(nèi)正常的代謝動態(tài)平衡，損傷小麥細胞[6-7]。SOD、CAT和POD是植物抗氧化酶系中的主要酶類[5-8]，能清除植物體內(nèi)活性氧自由基，使植物細胞免受傷害。在正常及逆境情況下，SOD、CAT和POD會升高，及時清除植物體內(nèi)活性氧，提高植物的抗逆性，但生物的抗性是有限的，如果脅迫超過閾值，自由基不能及時清除，同時會使SOD、CAT和POD3種酶的活性下降，MDA含量的升高，從而使細胞受到損傷。在本試驗中，與對照相比，濃度10 g/L的氧樂果顯著抑制了小麥幼苗SOD、CAT和POD活性，MDA含量增加，細胞膜受損害程度較大，導致小麥幼苗生長受到抑制，各生長指標明顯降低。

光合細菌能降解有機物，并產(chǎn)生泛酸、氨基酸、輔酶Q、5-氨基乙酰丙酸(ALA)卟啉類化合物、植物激素(如IAA,GA3、乙烯、細胞分裂素)和抗病毒因子等大量生物活性物質(zhì)[20-21]。這些物質(zhì)能激發(fā)植物細胞的活性，提高植物的光合作用效率和SOD、CAT和POD活性，從而使植物的抗逆性增強。本試驗研究結(jié)果表明，復合光合細菌菌劑能提高小麥幼苗SOD、CAT和POD活性，降低MDA含量，小麥細胞內(nèi)活性氧被及時清除，細胞受到了保護，與氧樂果單獨處理組相比，小麥的各生長指標有明顯提高，促進了小麥的生長。這與一些學者的研究結(jié)果一致，光合細菌能提高逆境下植物抗氧化酶活性，促進作物幼苗的生長[15-16]。但上述關于光合細菌的研究多采用單一菌劑，需菌量大，對逆境抑制植物生長的緩解作用較低,本試驗采用復合菌劑處理氧樂果脅迫下小麥幼苗，復合菌劑具有協(xié)同作用，通過分泌生理活性物質(zhì)，提高SOD、CAT和POD活性，灌根法處理組小麥相應酶活性可達到最高，與氧樂果單獨處理組相比，分別提高了216.70%、380.0%、199.89%。復合菌劑的不同施用方法對逆境毒害植物的緩解作用及對植物的促生效果存在差異[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，相應濃度復合菌劑處理下，灌根法對氧樂果毒性緩解作用較強，并且對小麥的促生效果較好。分析其原因可能是因為(1)復合菌劑能降解及轉(zhuǎn)化氧樂果，解除氧樂果對植物的毒害；(2)復合菌劑產(chǎn)生促生因子，促進小麥的生長。

光合細菌已被證明可以促進植物生長，防治病蟲害，但光合細菌菌劑作為外源微生物，應用效果與微生物濃度以及施用方法有關，菌液濃度過大，對植物生長有抑制作用。采用不同的菌劑施用方法，對植物的促生效果也不同。因此，對復合菌劑濃度及施用方法的篩選是必要的。本研究表明，采用灌根法，菌液濃度為108cfu/mL時，緩解或解除氧樂果對小麥生長的抑制作用最強。

綜上所述，濃度為106～108cfu/mL的復合菌劑與氧樂果復合處理后，均可產(chǎn)生不同程度的緩解或解除氧樂果對小麥生長的抑制作用，菌液濃度108cfu/mL，緩解作用最明顯；灌根法和噴施法相比，相應濃度下，灌根法處理組對氧樂果毒害有較強的緩解作用。

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EffectsofcompoundbacteriaPS21onseedlinggrowthandantioxidantenzymesinwheatunderomethoatestress

Ge Honglian, Liu Zhonghua

(SchoolofLifeScienceandAgronomy,ZhoukouNormalUniversity,Zhoukou466001,China)

The seedlings of wheat were cultured in liquid media containing omethoate, or the combination of omethoate and compound bacteria PS21. The seedling growth and antioxidant enzyme activities were examined for each medium, in order to explore the influence of compound bacteria PS21 on seedling growth and antioxidant enzymes activities in wheat under the stress of omethoate. The results showed that the different concentrations of compound bacteria could alleviate the omethoate toxicity in wheat plants to various degrees, and there was a positive correlation between alleviative effect and compound bacteria PS21 concentration. Under 108cfu/mL PS21 treatment, the omethoate stress suffered by wheat seedlings could be obviously alleviated. Compared to sole omethoate treatment, compound bacteria PS21 could remarkably increase plant height, stem diameter, dry weight, wet weight, and the contents of chlorophyll. With increasing concentration of compound bacteria PS21, antioxidant enzyme activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) increased to various degrees, whereas malondialdehyde (MDA) contents of seedling leaves decreased. The relieving effects were different among two application methods of compound bacteria PS21. Root-irrigating method significantly alleviated omethoate toxicity in wheat plants.

compound bacteria PS21; omethoate; seedling growth; wheat; antioxidant enzyme system

2013-11-06

：2014-05-08

河南省科技計劃項目(132300410032)；河南省教育廳科學技術重點項目(13B18027)

S 482.33

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.010

* 通信作者 E-mail：gehonglian2003@126.com