土荊芥花序和葉揮發(fā)油的抑菌作用及組分分析

陳利軍， 智亞楠， 王國君， 史洪中

(信陽農(nóng)林學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)系, 信陽 464000)

土荊芥花序和葉揮發(fā)油的抑菌作用及組分分析

陳利軍*， 智亞楠， 王國君， 史洪中

(信陽農(nóng)林學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)系, 信陽 464000)

采用水蒸氣蒸餾法分別提取采自河南信陽的土荊芥花序和葉的揮發(fā)油，采用GC-MS進(jìn)行組分分析，并測定揮發(fā)油的抑菌作用。結(jié)果表明：土荊芥花序和葉的揮發(fā)油的含油率分別為4.02%和1.64%；GC-MS從揮發(fā)油中分別分離到10個(gè)和9個(gè)組分，均鑒定出7個(gè)組分，占揮發(fā)油總量的98.431%和99.103%；揮發(fā)油的主要組分均為驅(qū)蛔素、2-蒈烯和α-松油烯，但相對含量差異較大；葉和花序的揮發(fā)油對小麥赤霉病菌具有強(qiáng)烈的熏蒸抑制作用，EC50分別為1.46 μL/皿和1.80 μL/皿。

土荊芥; 揮發(fā)油; GC-MS分析; 抑菌作用; 不同部位

土荊芥(ChenopodiumambrosioidesL.)為藜科一年生或多年生草本植物[1]，含豐富的揮發(fā)油。多項(xiàng)研究顯示土荊芥揮發(fā)油具殺蟲[2-5]、抑菌[6-9]、殺線蟲[10]、抗氧化[6]等生物活性，揮發(fā)油易揮發(fā)的特性使土荊芥揮發(fā)油有望作為倉儲、設(shè)施農(nóng)業(yè)、土壤等的熏蒸劑防控病、蟲、線蟲等的為害。原產(chǎn)于熱帶美洲的土荊芥，現(xiàn)廣泛分布于世界熱帶及溫帶地區(qū)[1]，在河南信陽也是常見的雜草，不同產(chǎn)地土荊芥揮發(fā)油化學(xué)組分和活性差異較大[5,7-9,11]，同一種植物的不同部位揮發(fā)油的含量、組分也不同[12]。已研究證明從產(chǎn)自河南信陽的新鮮土荊芥提取的揮發(fā)油對植物病原真菌具有極強(qiáng)的熏蒸抑制作用[13]。為了進(jìn)一步掌握河南信陽土荊芥不同部位揮發(fā)油的含量、組分及抑菌活性，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取土荊芥花序和葉片的揮發(fā)油，測定干品的含油率，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析揮發(fā)油的化學(xué)組分，并以小麥赤霉病菌為目標(biāo)菌，測定了揮發(fā)油的抑菌活性，以期為土荊芥在農(nóng)業(yè)上的開發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

土荊芥花序和葉：供試土荊芥全草于2012年8月下旬采自信陽市震雷山，室內(nèi)分花序和葉，自然風(fēng)干(10～12 d)后，剪為不超過0.5 cm的小段。

植物病原真菌菌株：小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，由信陽農(nóng)林學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離保存。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL)。

主要儀器與設(shè)備：Agilent 6850/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)，NIST05譜庫。

1.2 土荊芥花序和葉揮發(fā)油的提取

精確稱量樣品，采用水蒸氣蒸餾法，連續(xù)提取2 h，得淺黃色具濃郁氣味的油狀液體，即揮發(fā)油，計(jì)算含油率，重復(fù)3次。揮發(fā)油4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。含油?V/W)的計(jì)算公式如下：

含油率(%)=揮發(fā)油體積×100/樣品重量。

1.3 揮發(fā)油熏蒸抑菌作用測定

對小麥赤霉病菌菌絲生長的熏蒸抑制作用測定采用生長速率法：在直徑90 mm的培養(yǎng)皿中加入15 mL融化的PDA培養(yǎng)基(約60 ℃)，搖勻制成厚薄均勻平板，平板中央接種一塊直徑為5 mm的植物病原真菌菌餅。然后在皿蓋上放置一滅菌的直徑11 mm圓形濾紙片，吸取一定劑量的揮發(fā)油滴加到濾紙片上。皿底皿蓋對扣，parafilm封口膜密封，25 ℃培養(yǎng)，72 h后觀察植物病原真菌的生長情況，并采用十字交叉法測量病原真菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。揮發(fā)油的劑量設(shè)7個(gè)處理，分別為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0 μL，以僅放一濾紙片不滴加揮發(fā)油為對照，重復(fù)3次。

抑菌率(%)=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)×100/對照菌落生長直徑；

根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)概率換算表，將抑菌率換算成概率值，以概率值(Y)為縱坐標(biāo)、揮發(fā)油劑量的對數(shù)值(X)為橫坐標(biāo)建立毒力回歸方程，利用方程求得概率值為5和6.2816時(shí)的劑量即為EC50和EC90值。

1.4 揮發(fā)油GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，程序升溫，柱初溫60 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升溫速率升至90 ℃，再以10 ℃/min升溫速率升至180 ℃，載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍33～350 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 土荊芥花序和葉揮發(fā)油的含油率

采用水蒸氣蒸餾法提取土荊芥花序和葉的揮發(fā)油，含油率分別為4.02%和1.64%。

2.2 土荊芥花序和葉揮發(fā)油組分GC-MS分析

分別對土荊芥花序和葉的揮發(fā)油組分進(jìn)行GC-MS分析，總離子流圖見圖1。利用色譜峰面積歸一法測得各組分的相對含量，所得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST05質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對,分別從土荊芥花序和葉的揮發(fā)油中分離出10個(gè)和9個(gè)組分(表1)，其中花序揮發(fā)油中鑒定出了7個(gè)組分，占總成分的98.431%，葉揮發(fā)油中鑒定出了7個(gè)組分，占總成分的99.103%。從表1可以看出土荊芥花序和葉的揮發(fā)油組分基本相同，但相對含量差異較大。兩者揮發(fā)油主要組分均為驅(qū)蛔素、2-蒈烯和α-松油烯，其中相對含量最高的組分均為驅(qū)蛔素，相對含量分別為40.284%和34.425%。

表1土荊芥花序和葉的揮發(fā)油化學(xué)成分1)

Table1ThechemicalconstituentsoftheessentialoilsfromflowersandleavesofC.ambrosioides

峰號No．保留時(shí)間/mintR化合物Compounds分子式Formula相對含量/%Relativecontent花序Flower葉Leaf15．531α?松油烯α?TerpineneC10H1615．81723．38625．610p?傘花烴p?CymeneC10H147．7004．714313．335未鑒定Unknown0．6780．375414．1352?蒈烯2?CareneC10H1628．16023．567514．898未鑒定Unknown0．4850．522615．446未鑒定Unknown0．406-717．737驅(qū)蛔素AscaridoleC10H16O240．28434．425818．0263?甲基?4?異丙基酚3?Methyl?4?isopropylphenolC10H14O2．9735．375918．328麝香草酚ThymolC10H14O2．9245．3671028．135鄰苯二甲酸異丁基辛酯Phthalicacid，isobutyloctylesterC20H30O40．5752．269

1) -：無 -: n/a

圖1 土荊芥花序和葉揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

2.3 對小麥赤霉病菌的熏蒸抑制作用

以生長速率法在90 mm培養(yǎng)皿中測定土荊芥花序和葉的揮發(fā)油對小麥赤霉病菌的熏蒸抑制作用，結(jié)果見圖2、表2。從表2可看出，土荊芥花序和葉的揮發(fā)油對供試菌種菌絲生長都有一定的熏蒸抑制作用，抑制作用隨劑量增加而增強(qiáng)。在相同劑量條件下，葉的揮發(fā)油對小麥赤霉病菌的熏蒸抑制活性比花序揮發(fā)油的活性高。2.5 μL/皿的劑量，葉揮發(fā)油的抑制率達(dá)到78.64%，花序揮發(fā)油的抑制率達(dá)到64.55%。5 μL/皿和10 μL/皿的劑量對小麥赤霉病菌的抑制率均達(dá)到100%。

圖2 土荊芥花序和葉揮發(fā)油對小麥赤霉病菌的熏蒸抑制作用

表2土荊芥花序和葉揮發(fā)油對小麥赤霉病菌菌絲生長的熏蒸抑制作用

Table2FumigationantifungalactivityofessentialoilsfromflowersandleavesofC.ambrosioidestomycelialgrowthofF.graminearum

提取部位Extraction抑制率/%Inhibitoryratio0．5μL/皿1．0μL/皿1．5μL/皿2．0μL/皿2．5μL/皿5．0μL/皿10μL/皿花序Flower4．5528．1839．0955．4564．55100．00100．00葉Leaf5．4535．0051．3663．1878．64100．00100．00

表3為72 h后土荊芥花序和葉的揮發(fā)油對小麥赤霉病菌菌絲生長的熏蒸作用毒力測定結(jié)果，根據(jù)毒力回歸方程計(jì)算EC50和EC90。結(jié)果表明，揮發(fā)油對小麥赤霉病菌的毒力回歸方程具有很好的相關(guān)性，表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)，即隨著濃度不斷增加,揮發(fā)油對供試病原菌抑制活性逐漸增強(qiáng)。土荊芥花序和葉的揮發(fā)油均有強(qiáng)烈的抑菌作用。葉的揮發(fā)油活性較高，EC50僅為1.46 μL/皿，EC90為3.59 μL/皿；花序揮發(fā)油的EC50為1.80 μL/皿，EC90為4.98 μL/皿。

表3土荊芥花序和葉揮發(fā)油對小麥赤霉病菌菌絲生長的毒力測定結(jié)果

Table3ToxicityoftheessentialoilsfromflowersandleavesofC.ambrosioidestomycelialgrowthofF.graminearum

提取部位Extraction毒力回歸方程(Y=)Regressionequationofantifungalactivity相關(guān)系數(shù)CorrelativecoefficientEC50/μL·皿-1EC90/μL·皿-1花序Flower2．8990X+4．26030．98601．804．98葉Leaf3．2828X+4．45840．98721．463．59

3 結(jié)論與討論

采自河南信陽的土荊芥花序含油率為4.02%，遠(yuǎn)高于葉的含油率1.64%，也高于果實(shí)的含油率2.48%(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。而土荊芥莖的含油率極低，因此未被列入本研究對象。

GC-MS從土荊芥花序和葉揮發(fā)油中分別分離到10個(gè)和9個(gè)組分，其中均有7個(gè)組分被鑒定，分別占其揮發(fā)油總量的98.431%和99.103%。土荊芥花序和葉揮發(fā)油的組分基本相同，但相對含量差異較大。花序揮發(fā)油的主要成分為驅(qū)蛔素、2-蒈烯和α-松油烯，相對含量分別為40.284%、28.160%和15.817%；而葉揮發(fā)油的主要成分及相對含量高低順序與花序相同，其相對含量分別為34.425%，23.567%和23.386%，即α-松油烯的相對含量高于花序，驅(qū)蛔素和2-蒈烯的相對含量低于花序。驅(qū)蛔素、2-蒈烯和α-松油烯也在多地土荊芥的揮發(fā)油中檢測到，或是相對含量較高的成分[5,14]。

土荊芥花序和葉的揮發(fā)油對小麥赤霉病菌均有強(qiáng)烈的熏蒸抑制作用，且葉的揮發(fā)油活性較高，EC50為1.46 μL/皿。前人對土荊芥揮發(fā)油抑菌活性測定多采用平板給藥[6-7]，如Jardim等測定了采自巴西的土荊芥揮發(fā)油對8種采后真菌(Aspergillusspp.，Colletotrichumspp.，F(xiàn)usariumspp.等)的抑制活性，結(jié)果顯示，PDA培養(yǎng)基揮發(fā)油濃度為0.3%時(shí)，完全抑制所有真菌的生長，濃度為0.1%時(shí)，抑制率在90%～100%間[7]。因揮發(fā)油的易揮發(fā)性，更有利于通過熏蒸作用起到生物抑制活性，所以本研究測定的是土荊芥花序和葉揮發(fā)油的熏蒸抑菌作用。

多項(xiàng)研究證實(shí)土荊芥揮發(fā)油具有抑制真菌活性[6-7,9-13]，作用于真菌后，菌絲體結(jié)構(gòu)被破壞、原生質(zhì)體凝集、蛋白質(zhì)缺失或增加[9]，驅(qū)蛔素是主要的抑菌化合物[7]。p-傘花烴、麝香草酚等化合物也具有抑制真菌活性[7-15]。本研究土荊芥花序和葉揮發(fā)油組分含量最高的化合物均為驅(qū)蛔素，p-傘花烴和麝香草酚的相對含量之和均大于10%。土荊芥花序和葉的揮發(fā)油的強(qiáng)烈的熏蒸抑菌作用可能源于其含有多種抑菌物質(zhì)，且相對含量很高。土荊芥花序和葉的揮發(fā)油抑菌機(jī)制及單體組分在抑制真菌活性中的作用有待進(jìn)一步研究。

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TheantifungalactivityandchemicalconstituentanalysisofessentialoilsfromflowersandleavesofChenopodiumambrosioides

Chen Lijun, Zhi Yanan, Wang Guojun, Shi Hongzhong

(DepartmentofAgriculturalSciences,XinyangCollegeofAgricultureandForestry,Xinyang464000,China)

Essential oils from the flowers and leaves ofChenopodiumambrosioidesL. in Xinyang City of Henan Province were extracted by steam distillation, and their chemical constituents were analyzed by GC-MS. The antifungal activity of essential oils was also studied. The results showed that the yields of essential oils from the flowers and leaves were 4.02% and 1.64%, respectively. Ten and 9 constituents were isolated, and 7 constituents were identified, accounting for 98.431% and 99.103% of the total essential oils from the flowers and leaves by GC-MS, respectively. The main chemical constituents of all essential oils were ascaridole, 2-carene and α-terpinene, but the relative contents varied. The essential oils from leaves and flowers showed strong fumigation antifungal activity toFusariumgraminearum, with an EC50value of 1.46 μL/dish and 1.80 μL/dish, respectively.

Chenopodiumambrosioides; essential oil; GC-MS analysis; antifungal activity; different parts

2013-11-18

：2013-12-28

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(122102310257)；信陽市科技攻關(guān)項(xiàng)目(130016)

S 482.292

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.007

* 通信作者 E-mail: chlijun1980@163.com