杜仲內(nèi)生真菌中抗玉米紋枯病活性菌株的篩選

丁 婷， 孫微微， 王 帥， 江海洋

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,合肥 230036; 2.安徽省作物生物學重點實驗室, 合肥 230036)

杜仲內(nèi)生真菌中抗玉米紋枯病活性菌株的篩選

丁 婷1， 孫微微1， 王 帥1， 江海洋2*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,合肥 230036; 2.安徽省作物生物學重點實驗室, 合肥 230036)

對杜仲植物中的內(nèi)生真菌進行分離純化，共得到 32株菌株。以玉米紋枯病菌為指示菌，對杜仲內(nèi)生真菌進行對峙培養(yǎng)法、菌絲生長速率法以及盆栽控病試驗等研究。研究結果顯示，內(nèi)生真菌DZGS08對玉米紋枯病菌具有較好的拮抗作用，抑菌帶寬度大于10 mm；其菌絲生長速率試驗顯示DZGS08的發(fā)酵液抑菌率達到50.44 %；且玉米盆栽試驗結果表明，菌株DZGS08發(fā)酵液對玉米紋枯病的防治效果為34.03%。顯微觀察結果表明，拮抗菌株DZGS08能造成病原菌菌絲扭曲、畸形等現(xiàn)象。隨后，對該菌株的ITS 序列進行測定分析，序列分析和聚類結果表明該菌株為梭孢殼屬(Thielavia)的真菌。

玉米紋枯病菌； 杜仲； 抑菌機理

玉米紋枯病(maize sheath blight)又稱玉米尖眼點病，于1966年在我國吉林省首次發(fā)現(xiàn)，隨著玉米種植面積的擴大，高產(chǎn)密植技術的應用、玉米主產(chǎn)區(qū)的多年連作以及防治措施的不恰當，使得玉米紋枯病的發(fā)病率逐漸增加[1-4]，成為我國玉米產(chǎn)區(qū)的重要病害之一。迄今為止，對玉米紋枯病的防治主要以抗病品種選育和化學藥劑防治為主[5-6]。然而化學農(nóng)藥在使用過程中容易造成環(huán)境污染、藥害、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標、農(nóng)田生態(tài)平衡與生物多樣性被破壞等問題。因此，運用生物防治手段控制玉米紋枯病已成為研究的熱點和重點。植物內(nèi)生真菌通常是指一類全部或部分生活史是在健康植物體的根、莖及葉等組織中的細胞間隙或者細胞內(nèi)度過的真菌，其在植物體內(nèi)的存在不引起植物組織明顯的感染癥狀，是植株整個微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[7]。相關研究表明，部分植物內(nèi)生菌本身及其次生代謝產(chǎn)物不僅可以促進宿主植物的生長發(fā)育[8-9]，提高植物抗逆、抗蟲、抗病的能力[10-11]，且能增強植物對病原菌的抗性[12-14]。因此，圍繞植物內(nèi)生真菌及其代謝物所開展的研究正在興起，在此基礎上開發(fā)新型生物源農(nóng)藥也成為農(nóng)藥研發(fā)工作的重點。

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國名貴的中藥材之一。本研究利用組織分離法對杜仲的健康組織進行內(nèi)生真菌的分離純化，并以玉米紋枯病菌為指示菌，通過平板對峙培養(yǎng)、菌絲生長速率檢測等離體方法，結合玉米盆栽活體試驗，進行杜仲內(nèi)生真菌中抗玉米紋枯病菌活性菌株的分離、篩選以及鑒定等研究，研究結果將為植物病害的防治提供新型的生防資源，對藥用植物杜仲的深度開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

杜仲葉、莖、果實等健康組織，均采自于安徽農(nóng)業(yè)大學校園種植的杜仲。

1.1.2 供試玉米品種及植物病原真菌

玉米品種為‘鄭單958’；玉米紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)，菌株編號Ywk-3，均由安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院病理教研室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基：WA-抗生素培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，氨芐青霉素200 mg，鏈霉素200 mg，水1 000 mL，pH自然)；玉米紋枯病菌培養(yǎng)以及內(nèi)生真菌純化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)；內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基：PD培養(yǎng)液。

1.1.4 主要試劑

NaClO、CTAB提取液、氯仿、異戊醇、2×EasyTaqPCR SuperMix(TaKaRa)、10×Loading Buffer(TaKaRa)、DNA Marker(TaKaRa)、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(TaKaRa)、通用引物ITS1和ITS4(南京金斯瑞)；75%百菌清可濕性粉劑(先正達(蘇州)作物有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離和純化

取杜仲的健康組織(葉、莖和果實)，參照帖衛(wèi)芳等[15-16]的組織分離法，進行內(nèi)生真菌的分離，并采用組織印跡法對消毒效果進行驗證：將涂布有最后1次無菌水沖洗液的PDA平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3～5 d，觀察有無菌落產(chǎn)生，若平板表面無真菌生長，則表明杜仲組織表面滅菌徹底，所分離獲得的是杜仲內(nèi)生真菌而不是表面附生菌，否則，不能使用。平板培養(yǎng)2～3 d后，待培養(yǎng)組織邊緣有菌絲長出時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落轉移到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至產(chǎn)生單一菌落。經(jīng)過2～3次純化，得到純化菌株，對已純化的菌株編號，轉至 PDA 斜面培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，然后放入4 ℃的冰箱內(nèi)保藏備用。

1.2.2 杜仲拮抗內(nèi)生真菌的篩選

1.2.2.1平板對峙法

采用平板對峙培養(yǎng)法[17]，用內(nèi)徑為6 mm的打孔器分別在培養(yǎng)5～7 d的內(nèi)生真菌和玉米紋枯病菌的新鮮菌落邊緣打取菌餅，沿培養(yǎng)平板(直徑90 mm)直徑接種同質(zhì)等量的內(nèi)生真菌和病原菌的菌餅各一塊，兩點距中心均為35 mm。同時以只接病原菌的平板作為對照，每處理均設3個重復，置于25 ℃下黑暗恒溫培養(yǎng)。觀察各內(nèi)生真菌與病原菌菌落邊緣之間是否有抑菌圈產(chǎn)生，待對照長滿皿時，測量抑菌帶寬度(抑菌帶寬度為內(nèi)生真菌菌落邊緣與玉米紋枯病菌菌落邊緣之間的距離)，根據(jù)抑菌帶寬度評價其拮抗效果。

1.2.2.2帶毒平板法

用內(nèi)徑為6 mm的打孔器在內(nèi)生真菌新鮮菌落邊緣打取菌餅，分別接種10個菌餅于裝有200 mL PD培養(yǎng)液的錐形瓶中，置于25 ℃、180 r/min的搖床，黑暗培養(yǎng)10 d。發(fā)酵結束后，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)5 000 r/min離心10 min，取上清液真空凍干，凍干粉用無菌水配制成2 mg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抑菌試驗：采用菌絲生長速率法測定內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性, 在裝有10 mL PDA培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中加入發(fā)酵母液若干(內(nèi)生真菌發(fā)酵液凍干粉的最終含量為1 mg/皿)，并迅速混勻, 制成含藥培養(yǎng)基，冷卻后在每個平板中央放置直徑5 mm的供試菌的菌餅，以添加PD培養(yǎng)液作為陰性對照、以加入75%百菌清可濕性粉劑(100 μg /皿)作為抑菌試驗的陽性對照。每處理和對照均設3個重復，置于25 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)7 d，待陰性對照皿長滿菌后，十字交叉法測量菌落直徑，按下面的公式計算發(fā)酵濾液對菌絲生長的抑制率：

菌落生長距離=菌落平均直徑-5 mm;

抑制率(%)=(對照菌落生長距離-處理菌落生長距離)/對照菌落生長距離×100。

1.2.3 菌株DZGS08對玉米紋枯病菌拮抗作用的顯微觀察

滅菌載玻片中央放置15 mm×10 mm的無菌PDA薄膜一塊，然后挑取等量的DZGS08和玉米紋枯病菌菌絲分別接種于PDA薄膜兩平行邊的中點，將其放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗保濕培養(yǎng)，逐天鏡檢兩菌的相互作用并顯微拍照。

1.2.4 菌株DZGS08對玉米紋枯病的防效評價

將玉米種子播種于盆缽中(盆缽口徑為30 cm)，每盆2株，進行常規(guī)管理，待其進入拔節(jié)期的10～12葉期，進行玉米紋枯病防治試驗，參照1.2.2.1中的方法打取玉米紋枯病菌菌餅，在每株玉米植株近地面的第1葉鞘內(nèi)嵌入3 塊菌餅，接種后，保持盆缽土壤濕潤，3 d后進行不同處理，每處理10株玉米，處理①：噴清水；處理②：噴DZGS08發(fā)酵液(發(fā)酵液處理方法同1.2.2.2，濃度為2 mg/mL，并經(jīng)孔徑0.22 μm的細菌過濾器過濾除菌)50 mL；處理③：噴百菌清溶液50 mL(75%百菌清可濕性粉劑先用少量丙酮溶解，再用無菌水配成200 mg/L的溶液)。在玉米蠟熟期，病情基本穩(wěn)定后，逐株調(diào)查記載病情級別。玉米紋枯病的病級記載采用國際小麥玉米改良中心(CIMMYT)提供的病級分級標準[18]。按照以下公式計算各處理的病情指數(shù)并計算防效：

病情指數(shù)=

1.2.5 活性菌株DZGS08分子鑒定

CTAB法提取DZGS08菌株的基因組DNA，利用真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCGTTATTGATATGC-3′)擴增菌株的ITS和5.8 S rDNA序列。參照Kim[19]的PCR反應采用50 μL反應體系[16]，反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性 30 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 45 s，35個循環(huán)；最后 72 ℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

所得菌株的ITS序列在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST軟件與GenBank中已知屬種的ITS進行序列比對和同源性分析，選取比對后指標靠前的相似序列和分類比較相近的種屬序列，利用MEGA 4.1軟件對所獲菌株DZGS08的ITS部分序列進行多重序列比對，并采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap軟件對進化樹進行1 000次可信度分析，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹中的組群關系對菌株進行分類。

2 結果與分析

2.1 杜仲內(nèi)生真菌的分離和鑒定

從杜仲的健康葉、莖和果實中共分離到32株內(nèi)生真菌，其中葉部14株，占分離總株數(shù)的43.74%；莖9株，占分離總株數(shù)的28.13%；果實9株，占分離總株數(shù)的28.13%(表1)，即：內(nèi)生真菌在杜仲葉部分布最多，莖部居中，而果實內(nèi)較少。此外，杜仲內(nèi)生真菌在種群組成上具有多樣性，分離純化獲得的32株內(nèi)生真菌在種群類別及杜仲不同組織中的分布數(shù)量如圖1所示，32株內(nèi)生真菌共歸為9個屬，其中，在杜仲3個部位中均有分布的為黑孢霉屬(Nigrospora)、擬莖點霉屬(Phomopsis)、炭疽菌屬(Colletotrichum)3個屬，且炭疽菌屬的菌株數(shù)量最多，在分離得到的32株內(nèi)生真菌中有12株屬于炭疽菌屬，占分離菌株總數(shù)的37.50%；此外，一些屬在杜仲組織中有著特異專化性，如僅在葉中分布的擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、肉座菌屬(Hypocrea)，僅在杜仲果實中有所分布的梭孢殼屬(Thielavia)、葡萄座腔屬(Botryosphaeria)。

表1 杜仲不同組織內(nèi)生真菌的分離結果Table 1 Isolation of endophytic fungi fromdifferent tissue of E.ulmoides

圖1 杜仲組織中分離的內(nèi)生真菌數(shù)量及種類Fig.1 The number and taxa of endophytic fungi isolatedfrom leaves, stems and fruits of E.ulmoides

2.2 玉米紋枯病拮抗菌株篩選

以玉米紋枯病菌為指示菌，對32株杜仲內(nèi)生真菌進行平板對峙篩選試驗，結果如表2所示，有22株內(nèi)生真菌顯示出對玉米紋枯病菌的抑制作用，占分離得到的內(nèi)生真菌總數(shù)的68.75%，其中，12株內(nèi)生真菌的抑菌帶寬度在0～5 mm之間，9株內(nèi)生真菌的抑菌帶寬度在5～10 mm之間，僅有菌株DZGS08抑菌帶寬度為13.06 mm，對玉米紋枯病菌的抑菌效果最好。

表2 杜仲內(nèi)生真菌對玉米紋枯病菌菌絲生長的抑制作用1)Table 2 Antifungal activities of endophytic fungifrom E.ulmoides against R.solani

1) 同列數(shù)字后不同英文字母表示在P=0.05水平上差異顯著(Duncan多重比較法)。
The data followed with different letter in the same column are significantly different atP=0.05 by Duncan′s test.

采用菌絲生長速率法，以玉米紋枯病菌為指示菌，對32株杜仲內(nèi)生真菌的發(fā)酵液進行抑菌活性的篩選。結果表明杜仲內(nèi)生真菌中含有著豐富的抗玉米紋枯病菌資源，在32株內(nèi)生真菌發(fā)酵液中，有30株內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物(即發(fā)酵液)對玉米紋枯病菌有不同程度的抑制效果(見表2)，抑制率在0.37 %～50.44 %之間，其中菌株DZGS08發(fā)酵液對玉米紋枯病菌有較好的抑制效果(圖2)，其抑制率達到50.44%，但仍低于陽性對照75%百菌清可濕性粉劑對玉米紋枯病菌的抑制率(75.13%)(表2)。由以上試驗可知，杜仲中分離的多數(shù)菌株對玉米紋枯病菌均具有較好的抗菌活性，并以DZGS08的抑菌效果最佳。

圖2 菌株DZGS08發(fā)酵液對玉米紋枯病菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of the fermentation liquid of strain DZGS08 on R.solani

2.3 菌株DZGS08對玉米紋枯病菌拮抗作用的顯微觀察

2.3.1 菌株DZGS08對玉米紋枯病菌菌絲生長的抑制

逐日觀察兩菌的相互作用，發(fā)現(xiàn)接種3 d后，菌株DZGS08與病原菌開始互作， 隨著DZGS08菌絲的生長、擴展，其展現(xiàn)出較強的空間競爭能力，使對峙面的玉米紋枯病菌菌絲生長受到明顯的抑制(圖3a)。培養(yǎng)7 d后，DZGS08內(nèi)生菌菌落覆蓋大部分培養(yǎng)基平板，且在對峙培養(yǎng)的過程中產(chǎn)生明顯的抑菌帶(圖3 b)，究其原因，可能是菌株DZGS08菌株在生長過程中產(chǎn)生抗生素等相關的代謝產(chǎn)物，從而在后期的對峙培養(yǎng)中產(chǎn)生抑菌帶。此外，玉米紋枯病菌在對峙培養(yǎng)后期(培養(yǎng)第5天)菌絲體出現(xiàn)明顯的老化萎縮現(xiàn)象，且生長后期玉米紋枯病菌菌落與DZGS08菌落均未出現(xiàn)明顯的顏色變化。

2.3.2 菌株DZGS08與玉米紋枯病菌對峙培養(yǎng)的顯微觀察結果

顯微觀察抑菌帶邊緣生長受阻的玉米紋枯病菌菌絲，結果表明，對峙培養(yǎng)中的玉米紋枯病菌的菌絲生長之所以受到抑制，主要是由于和正常的玉米紋枯病菌菌絲相比，發(fā)生了畸形，節(jié)間縮短、菌絲變粗，且菌絲頂端和分支處有膨大現(xiàn)象(圖3f)，而正常的玉米紋枯病菌菌絲體細長、光滑而均勻(圖3e)。

圖3 菌株DZGS08與玉米紋枯病菌的對峙培養(yǎng)Fig.3 The results of confronting culture experiment in strain DZGS08 and R.solani

2.4 DZGS08防治玉米紋枯病的盆栽試驗

拮抗菌DZGS08對玉米紋枯病的盆栽防治試驗結果如表3 所示， 菌株DZGS08發(fā)酵液對玉米紋枯病菌的防治效果為34.03%，雖低于75%百菌清WP對玉米紋枯病菌的防治效果(50.74 %)，但試驗結果仍表明，拮抗菌DZGS08發(fā)酵液對玉米紋枯病有一定的防效。

表3 DZGS08發(fā)酵液對玉米紋枯病菌的防效Table 3 Control effect of the fermentation broth of DZGS08 on R.solani in maize pot experiment

2.5 DZGS08菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株DZGS08 ITS序列的測序結果在NCBI上進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)在親緣關系相近的前100個菌株中，DZGS08與Thielaviasp.B27的相似性最高，同源性達99%，利用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，DZGS08菌株與Thielaviasp.B27親緣關系最近，單獨構成一個分支，表明DZGS08菌株可能屬于梭孢殼屬(Thielavia)。DIGS08 ITS序列在GenBank中的登錄號為JX179252。隨后，結合菌株形態(tài)學觀察，DZGS08菌株在PDA培養(yǎng)基平板上形成圓形菌落，菌落正面邊緣灰白色，中央墨綠色，沒有氣生菌絲，在PDA培養(yǎng)基上也不產(chǎn)孢(見圖3d)，參考ITS序列分析結果，最終將DZGS08菌株初步鑒定為梭孢殼屬(Thielavia)的未知種。

圖4 菌株DZGS08 ITS堿基序列的聚類分析Fig.4 The neighbor-joining phylogeny of ITS sequence of strain DZGS08

3 討論

通過組織分離法，本試驗從杜仲的健康組織中共分離得到32株內(nèi)生真菌，分別歸為9個屬。已有相關研究表明，藥用植物杜仲中含有種群類型豐富的內(nèi)生真菌，如田從麗等人從杜仲中分離得到鏈格孢屬、青霉屬、曲霉屬、莖點霉屬等共15個屬的種群[20]；霍娟等人則從杜仲健康組織中分離得到蜜孢霉屬、刺孢殼屬、交鏈孢屬、刺盤孢屬等共9屬的內(nèi)生真菌[21]。將本試驗的分離鑒定結果與已報道的杜仲健康組織中的內(nèi)生真菌種群[20-22]相比，發(fā)現(xiàn)僅有鏈格孢屬(Alternaria)等少數(shù)種群一致。究其原因，可能是杜仲內(nèi)生真菌的類群組成及分布與其宿主所處地理位置不同有關。本課題組僅就安徽農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)的杜仲樣品進行了采集研究，后續(xù)試驗將采集不同地域環(huán)境中的樣品，通過多次重復分離來獲得更多可培養(yǎng)內(nèi)生真菌，從而更好地分析其種屬分布特性及遺傳多樣性，準確了解杜仲內(nèi)生真菌種群分布，為篩選杜仲內(nèi)生真菌中具有抑菌活性的有益菌株提供基礎。此外，本研究分離到的擬莖點霉屬(Phomopsis)、炭疽菌屬(Colletotrichum)等菌株既是重要的植物病原菌，也是廣譜內(nèi)生菌，在多種植物體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)[22-24]，目前，炭疽菌屬和擬莖點霉屬的部分菌種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已成為重要的生防資源，如從植物黃花蒿和雷公藤的莖內(nèi)分離到的2株內(nèi)生炭疽菌，可產(chǎn)生一系列對植物病原真菌和細菌都有良好抑制作用的化合物[25-26]；且PhomopsisB3對水稻的生長及其產(chǎn)量起到明顯的促進作用[27]。由此可見，炭疽菌屬及擬莖點霉屬的部分真菌具有的抑菌及促生長等活性，在植物病害防治及增產(chǎn)等方面具有一定應用潛力。

拮抗微生物之所以能夠防治植物病害，抑菌機理主要體現(xiàn)在拮抗微生物具有較強的空間和營養(yǎng)競爭能力，能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制植物病原菌的生長，在植物遇到病原菌侵襲時，能夠誘導植物產(chǎn)生抗病性等多方面。本研究中，內(nèi)生菌DZGS08可抑制玉米紋枯病菌菌落生長，產(chǎn)生較為明顯的抑菌帶，且顯微觀察的結果表明，在兩者對峙培養(yǎng)過程中，生長受到抑制的玉米紋枯病菌菌絲部分發(fā)生畸形。這些現(xiàn)象可能是因為DZGS08菌株在培養(yǎng)過程中如枯草芽胞桿菌一樣產(chǎn)生活性抗菌蛋白造成植物病原菌的菌絲扭曲、折疊，達到抑制植物病原菌生長的目的[28]，又或是菌株在生長中能分泌抗生素類物質(zhì)，從而抑制玉米紋枯病菌的生長，有待于作進一步的深入研究。

通過帶毒平板法對杜仲內(nèi)生真菌的發(fā)酵液抑菌活性進行測定，發(fā)現(xiàn)DZGS08菌株發(fā)酵液(1 mg/皿)對玉米紋枯病菌的生長抑制率達到了50%以上；但在玉米盆栽防治試驗中，DZGS08 菌株發(fā)酵液對玉米紋枯病的防治效果較低，防效為34.03%，可能是由于實際的玉米盆栽試驗中，玉米活體在生長過程中受到外界環(huán)境因素以及一些人為因素的影響而造成的。此外，本試驗僅在在玉米蠟熟期對不同處理的玉米植株進行了病害調(diào)查，得到的數(shù)據(jù)僅反映出截至玉米蠟熟期，拮抗菌DZGS08對玉米紋枯病的防治效果為34.03%，但是隨著玉米生長以及玉米紋枯病的擴展，拮抗菌DZGS08發(fā)酵液對玉米紋枯病的防效是否能夠保持穩(wěn)定，或呈上升又或是下降趨勢，還有待于持續(xù)跟蹤調(diào)查。

長久以來，化學農(nóng)藥在病蟲害綜合防治，保證農(nóng)林作物穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)等方面均起到了重要作用。然而，隨著科學技術的快速發(fā)展，化學農(nóng)藥的副作用所造成的一系列問題越來越突出，如化學農(nóng)藥的過度施用引起的“3R”問題，對生物多樣性的破壞以及對人體造成的間接傷害等。因此，利用生物防治，尤其是篩選和利用有益微生物防治植物病害在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的關注。目前，國內(nèi)外對玉米紋枯病生防菌的篩選研究主要集中在枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)[29]、木霉(Trichodermaspp.)[30-31]、綠色黏帚霉(Gliocladiumvirens)[32]等菌群。本研究中，獲得1株對玉米紋枯病菌有較好抑菌活性的杜仲內(nèi)生真菌DZGS08，利用形態(tài)學觀察以及分子生物學方法鑒定其為梭孢殼屬(Thielavia)真菌。梭孢殼屬(Thielavia)真菌在多種植物內(nèi)存在[33-34]，相關研究[33]表明梭孢殼屬真菌對金黃色葡萄球菌等醫(yī)學病原菌的生長具有較好的抑制作用，但對植物病原菌的抑制作用則鮮有報道，本試驗中， DZGS08菌株發(fā)酵液對玉米紋枯病的防治效果為34.03%，和文獻報道的枯草芽胞桿菌菌懸液對玉米紋枯病的防治效果(43.01%)[29]以及木霉發(fā)酵液對玉米紋枯病的防治效果(40.07%)[35]比較接近，因此，在玉米紋枯病害的防治中可作為一株有較好開發(fā)應用前景的生防真菌。在后續(xù)研究中，將利用綠色熒光蛋白(GFP)標記，對該菌株的內(nèi)生性進行深入驗證，并對菌株對玉米植株促生性等方面展開研究，以期為DZGS08菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的開發(fā)利用奠定理論基礎。

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ScreeningofendophyticfungiisolatedfromEucommiaulmoidesOliv.withantimicrobialactivityagainstmaizeRhizoctoniasolani

Ding Ting1， Sun Weiwei1， Wang Shuai1， Jiang Haiyang2

(1.CollegeofPlantProtection,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China; 2.AnhuiProvincialKeyLaboratoryofCropBiology,Hefei230036,China)

In this study, thirty-two strains of endophytic fungi were isolated from the leaves, stems and fruits ofEucommiaulmoides. And the antimicrobial activity of endophytic fungi was examined against maizeRhizoctoniasolaniusing confront antibiotic culture experiment, growth inhibition measurements, disease-control pot experiment. The results indicated the strain DZGS08 had strong inhibit against maizeRhizoctoniasolaniwith more than 10 mm inhibition zone, and the fermentation broth of DZGS08 had a strong inhibitory effect on the pathogenic fungi, its inhibitory rates onRhizoctoniasolani; was 50.44%, Moreover, the control efficacy of the fermentation broth of the DZGS08 was 34.03% by pot experiment. It was revealed microscopically the strain DZGS08 could cause the abnormity and tortuosity of mycelial of phytopathogen and so on. Then, the strain DZGS08 was identified of molecular, the results showed that the strain DZGS08 belonged toThielavia.

Rhizoctoniasolani;Eucommiaulmoides; antimicrobial mechanism

2013-12-09

：2014-03-27

國家自然科學基金青年科學基金項目(31371980)；安徽省高校省級優(yōu)秀青年人才基金項目(2010SQRL063)；安徽農(nóng)業(yè)大學穩(wěn)定和引進人才科研資助研究項目

S 482.292

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.006

* 通信作者 E-mail:jd1998@gmail.com