侵染甜椒的番茄褪綠病毒的分子鑒定

趙汝娜，王 蓉，師迎春，張桂娟，原 鍇，范在豐，周 濤*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京 100193；2.北京市植物保護(hù)站，北京 100029；3.北京市大興區(qū)植保植檢站，北京 102600；4.北京市房山區(qū)植物保護(hù)站，北京 102488)

侵染甜椒的番茄褪綠病毒的分子鑒定

趙汝娜1，王 蓉1，師迎春2，張桂娟3，原 鍇4，范在豐1，周 濤1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系，北京 100193；2.北京市植物保護(hù)站，北京 100029；3.北京市大興區(qū)植保植檢站，北京 102600；4.北京市房山區(qū)植物保護(hù)站，北京 102488)

番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus, ToCV)是一種由粉虱傳播的RNA病毒，可以侵染番茄和辣椒等常見(jiàn)蔬菜，已在世界多地造成嚴(yán)重危害。2012年在北京市大興區(qū)調(diào)查蔬菜病毒病時(shí)發(fā)現(xiàn)保護(hù)地栽培的甜椒植株表現(xiàn)脈間褪綠癥狀，且植株上煙粉虱數(shù)量多，初步推測(cè)為T(mén)oCV危害。通過(guò)提取顯癥樣品總RNA，利用ToCV特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，擴(kuò)增得到463 bp的目標(biāo)條帶。通過(guò)測(cè)序和核苷酸序列比對(duì)分析，表明該序列與國(guó)外已報(bào)道的ToCV HSP70h(the heat shock protein 70 homolog，熱激蛋白70家族)基因序列相似性為99%。這是對(duì)ToCV在我國(guó)侵染甜椒的首次報(bào)道。

番茄褪綠病毒； 甜椒； RT-PCR

番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus, ToCV)是危害世界許多地區(qū)多種作物的病毒，引起嚴(yán)重的褪綠和黃化病害，典型癥狀是植株下部葉片黃化，葉脈濃綠而脈間褪綠，與缺素癥狀非常類(lèi)似[1]。該病毒最初在20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)于美國(guó)[1]，目前已經(jīng)蔓延至世界多地[2-5]。ToCV為長(zhǎng)線(xiàn)形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus)成員，傳播介體為粉虱，包括B型煙粉虱(Bemisiatabacibiotype B)、Q形煙粉虱(B.tabacibiotype Q)、A型煙粉虱(B.tabacibiotype A)、溫室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)和紋翅粉虱(T.abutilonea)，但不能通過(guò)汁液摩擦傳播。常見(jiàn)的寄主包括茄科(番茄、甜椒、煙草等)、番杏科、莧科、夾竹桃科、藜科、菊科和藍(lán)雪科等多種植物[6]。

2012年，筆者在對(duì)常見(jiàn)蔬菜病毒病害的調(diào)查中，在北京先后發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)ToCV侵染典型癥狀的番茄和甜椒植株，其中ToCV對(duì)番茄植株的侵染已經(jīng)報(bào)道[7]。發(fā)病的甜椒植株葉片呈現(xiàn)脈間黃化，變脆易折，嚴(yán)重者葉片呈黃褐色，甚至出現(xiàn)壞死。該癥狀與ToCV引起的病害典型癥狀一致[1]。采回發(fā)病甜椒樣品，提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)、序列測(cè)定和比對(duì)分析，鑒定為T(mén)oCV。這是該病毒侵染甜椒在我國(guó)發(fā)生的首次報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2012年10月在北京大興區(qū)甜椒種植大棚中采集表現(xiàn)典型脈間褪綠癥狀且?guī)в悬S褐色病斑的甜椒葉片，整理后一部分直接用于提取總RNA，其余存于-20 ℃冰箱備用。

1.2 葉片總RNA的提取

利用TRIzol法提取甜椒葉片總RNA。取癥狀典型的葉片于液氮中研磨，將0.1 g粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，迅速加入1 mL TRIzol試劑，振蕩混勻，室溫放置5 min后離心，將上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入 0.2 mL氯仿并混勻，室溫放置5 min。再次離心后，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇并混勻。室溫放置30 min。離心后，用75% 乙醇洗滌沉淀。最后用無(wú)核酶的去離子水溶解。

1.3 反轉(zhuǎn)錄PCR、序列克隆和測(cè)定

在無(wú)核酶的離心管中加入總RNA(2 μg)，0.5 μL 10 μmol/L Oligo (dT) primer，0.5 μL 10 μmol/L Random hexamers primer和1 μL dNTP Mix (10 mmol/L)，用無(wú)核酶的超純水補(bǔ)充總體積至18.5 μL；65 ℃ 反應(yīng)5 min，然后立即冰浴2 min。短暫離心后加入5 μL 5× first-strand buffer，0.5 μL RNAase Inhibitor和1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻，37 ℃反應(yīng)60 min。

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用Dovas等[8]報(bào)道的檢測(cè)ToCV的特異性引物ToC-5(5′-GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCAGT-3′)和ToC-6(5′-AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTC-3′)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增ToCV編碼的HSP70h基因部分序列。25 μL PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μL，dNTPs (10 mmol/μL)0.65 μL，上游引物ToC-5和下游引物ToC-6各0.5 μL，10×反應(yīng)緩沖液2.5 μL，TaqDNA Polymerase 0.25 μL(5U/μL)，ddH2O 18.6 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃變性3 min，按下列條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。全部PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取約500 bp的目標(biāo)條帶，用凝膠回收試劑盒回收純化后，克隆到pMD18-T載體(TaKaRa，大連)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。陽(yáng)性克隆經(jīng)驗(yàn)證后，由華大基因公司進(jìn)行測(cè)序獲得序列。

1.4 序列比對(duì)分析

利用NCBI序列比對(duì)工具BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序nucleotide blast比對(duì)分析克隆獲得的序列，根據(jù)相似性確定病毒種類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測(cè)

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用ToCV的特異性引物ToC-5和ToC-6進(jìn)行PCR檢測(cè)，從表現(xiàn)典型癥狀的甜椒樣品中擴(kuò)增得到約450 bp的條帶，與感染ToCV的番茄陽(yáng)性對(duì)照樣品[7]的擴(kuò)增結(jié)果一致(圖1)。結(jié)果表明采集的甜椒樣品可能被ToCV侵染危害。

圖1 利用RT-PCR在甜椒樣品中檢測(cè)ToCVFig.1 Detection of ToCV on sweet pepper samples using RT-PCR

2.2 ToCV北京分離物部分序列分析

將PCR擴(kuò)增獲得的約450 bp的片段純化，克隆到pMD18-T載體并進(jìn)行序列測(cè)定。經(jīng)BLAST程序nucleotide blast進(jìn)行序列相似性檢索和分析的結(jié)果表明：檢測(cè)為陽(yáng)性的來(lái)自北京郊區(qū)的甜椒樣品cDNA擴(kuò)增得到的候選病毒基因組部分序列，與ToCV序列相似性最高，均為99%，表明在北京郊區(qū)甜椒生產(chǎn)大棚中采集的甜椒樣品確系被ToCV感染。

3 討論

雖然國(guó)外已經(jīng)有較多研究和報(bào)道[1-6]，在我國(guó)ToCV是最近被發(fā)現(xiàn)的一種新病毒，其在我國(guó)的發(fā)生和危害情況需要開(kāi)展詳細(xì)的調(diào)查和研究。ToCV引起的葉片褪綠黃化癥狀類(lèi)似于植株缺素癥狀，導(dǎo)致在病害調(diào)查中不易對(duì)其發(fā)生進(jìn)行正確判斷。雖然ToCV引起的褪綠黃化病不導(dǎo)致絕產(chǎn)，但其引起的損失多在30%～40%，減產(chǎn)明顯[9]。因ToCV的傳播介體煙粉虱食性雜，在多種作物及雜草上極為常見(jiàn)[10]，尤其在保護(hù)地栽培條件下可以周年發(fā)生，所以導(dǎo)致這類(lèi)褪綠黃化病毒病大面積發(fā)生和蔓延的可能性非常高。

由煙粉虱傳播的病毒病已給我國(guó)番茄等茄科作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，其中最為典型的病害是由番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)等一些雙生病毒引起的番茄黃化曲葉病毒病，但TYLCV侵染甜椒一般不引起明顯的癥狀，對(duì)甜椒產(chǎn)量的影響也不明顯[11]，所以目前在甜椒生產(chǎn)中一般不注意防治煙粉虱。隨著ToCV的發(fā)生，其對(duì)甜椒生產(chǎn)的危害將逐漸增加，如不加以重點(diǎn)防范，必將在生產(chǎn)上造成嚴(yán)重?fù)p失。由于國(guó)內(nèi)外目前沒(méi)有對(duì)ToCV的抗病品種，生產(chǎn)中應(yīng)注意采取綜合措施防治煙粉虱和該病毒的發(fā)生和傳播。防治策略和方法可以參照許多文獻(xiàn)中介紹的番茄黃化曲葉病毒病的綜合防治方法，主要措施是培育無(wú)毒幼苗，防治煙粉虱和清除其他寄主。

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MolecularidentificationofTomatochlorosisvirusonsweetpepper

Zhao Runa1,Wang Rong1,Shi Yingchun2,Zhang Guijuan3,Yuan Kai4,Fan Zaifeng1,Zhou Tao1

(1.DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China; 2.BeijingStationofPlantProtection,Beijing100029,China; 3.DaxingStationofPlantProtectionandQuarantine,Beijing102600,China;4.FangshanStationofPlantProtection,Beijing102488,China)

Tomatochlorosisvirus(ToCV), a RNA virus transmitted by whiteflies, induces severe damage to tomato and pepper production in the world.In a survey of virus disease on vegetables in 2012, a yellowing disease was found on greenhouse grown pepper plants in Daxing district, Beijing.Meanwhile, a large number of whiteflies (Bemisiatabaci)were found on pepper plants.We suspected the diseased pepper plants were infected by ToCV.A Reverse Transcript-PCR assay was performed with total RNA isolated from diseased samples using specific primers for ToCV.Amplified DNA fragments (463 bp) were obtained.The nucleotide sequences of the fragments had the highest identity (99%) with that of ToCV.To our knowledge, this is the first report of ToCV on pepper in China.

Tomatochlorosisvirus; sweet pepper; RT-PCR

2013-04-02

： 2013-04-28

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303028)；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1042)

S 432.41

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.024

* 通信作者 E-mail:taozhoucau@cau.edu.cn