異草松降解酶在不同條件下降解效果的比較研究

劉亞光，劉 冰，李曉雨，李 威，井秋月，何付麗

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030)

劉亞光*，劉 冰，李曉雨，李 威，井秋月，何付麗

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030)

為了驗證異噁草松高效降解菌W2的降解效果，應(yīng)用氣相色譜法檢測異噁草松含量，考察了在室內(nèi)條件下不同培養(yǎng)溫度、土壤濕度、原酶液添加量和異噁草松初始添加濃度對酶液降解異噁草松的影響。結(jié)果表明：在培養(yǎng)溫度為30 ℃、土壤濕度為田間最大持水量的50%、原酶液添加量為2 mL/kg且酶活力為1.066 μg/mL·min的條件下，30 d降解酶對異噁草松的降解率最高，達(dá)到81.7%，與添加菌懸液處理和藥劑對照相比分別提高了31.0%和58.5%，降解半衰期(12.3 d)比菌懸液和藥劑對照分別縮短了16.9 d和68.3 d，而異噁草松初始添加濃度對降解酶的降解效果影響差異不顯著。

異噁草松； 降解酶； 降解效果

異噁草松(clomazone)主要作為苗前或苗后選擇性除草劑防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草[1-2]，但在土壤中不易分解。大多數(shù)農(nóng)藥的降解是通過微生物分泌的降解酶與底物發(fā)生酶促反應(yīng)而完成的[3-4]，異噁草松在土壤中降解也主要依靠微生物活動[5-6]，由此可見利用微生物降解殘留除草劑，是一種安全有效并切實可行的途徑。鑒于微生物對異噁草松降解的實質(zhì)是酶促反應(yīng)[7]，本課題組從降解酶的角度探索異噁草松的微生物降解問題，并展開深入研究，已成功篩選出異噁草松高效降解菌W2[8]，并對影響降解菌W2生物修復(fù)效果的因素進(jìn)行了研究[9]，探明了W2的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基[10]，及其有效酶成分在細(xì)胞中的位置和降解酶的酶學(xué)性質(zhì)[11]，本文考察不同條件對降解酶降解異噁草松的影響，是在前者研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入。

本研究采用氣相色譜法檢測異噁草松的含量[12-14]，考察了室內(nèi)條件下不同培養(yǎng)溫度、土壤濕度、原酶液添加量和異噁草松初始添加濃度對酶液降解異噁草松的影響，系統(tǒng)地研究了異噁草松降解酶在不同條件下的降解效果，為降解菌酶在實際生產(chǎn)中用于解決異噁草松的殘留危害問題提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。目前酶固定化技術(shù)正在得到廣泛的研究與開展[15-17]，本研究得出降解酶的最適反應(yīng)條件，為酶的固定化生產(chǎn)奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藥品：99.0%異噁草松標(biāo)準(zhǔn)品，哈爾濱利民農(nóng)化有限公司提供。

供試儀器：氣相色譜儀GC-2010，日本島津公司。

供試菌種：異噁草松高效降解菌：由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草與農(nóng)藥實驗室提供，篩選自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊農(nóng)場長期施用過長殘效除草劑異噁草松的地塊，菌株編號為W2(短桿菌屬Brevibacterium)[8]。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解條件對降解酶降解異噁草松影響的研究

1.2.1.1降解酶液的制備

采用搖瓶培養(yǎng)法對異噁草松降解菌W2進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為：乳糖2%，酵母浸提液2%，CaCl20.6%，KCl 0.4%，ZnSO40.02%，K2HPO40.015%，異噁草松100 μg/L；培養(yǎng)條件為：種齡38 h，搖瓶裝液量50 mL/250 mL，接種量2.5%，初始pH7.0，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min；產(chǎn)酶終點時間為48 h。收集菌體，按照每1 g樣品加3 mL緩沖液的比例將菌體懸浮于緩沖溶液中，冰浴下應(yīng)用功率為350 W的超聲波破碎儀破碎20次，每次6 s，間隔8 s，然后7 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，收集得胞內(nèi)粗酶液。酶液為現(xiàn)配現(xiàn)用，酶活力為1.066 μg/mL·min。

1.2.1.2溫度對降解酶降解效果的影響

于自然風(fēng)干的25 g土壤中添加初始濃度為5 mg/L的異噁草松溶液，調(diào)節(jié)土壤濕度為田間最大持水量的50%，用噴霧器向土壤中均勻噴灑原酶液，并邊噴灑邊攪拌，使酶液在土壤中均勻分布，且含量為2 mL/kg，設(shè)3次重復(fù)。將處理后的土壤裝入潔凈的培養(yǎng)皿中，并蓋好皿蓋，記錄總重量，每2 d稱量，加水補(bǔ)足，以保持土壤的含水量不變。于20、25、30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置，分別于0、1、3、5、10、15、20、30 d后檢測異噁草松含量，計算異噁草松降解率和半衰期。以添加相同濃度菌懸液的異噁草松土壤作為菌懸液處理，以不添加粗酶液和菌懸液的異噁草松土壤作為藥劑對照。

1.2.1.3土壤濕度對降解酶降解效果的影響

調(diào)節(jié)供試土壤的含水量為田間最大持水量的37.5%、50%和62.5%，于25 g自然風(fēng)干的土壤中添加異噁草松，使其初始濃度為5 mg/L，并添加原酶液，處理如1.2.1.2。于30 ℃條件下分別放置0、1、3、5、10、15、20、30 d后，應(yīng)用氣相儀檢測異噁草松含量，計算異噁草松降解率和半衰期。以添加相同濃度菌懸液的異噁草松土壤作為菌懸液處理，以不添加粗酶液和菌懸液的異噁草松土壤作為藥劑對照。

1.2.1.4酶液添加量對降解酶降解效果的影響

在土壤中添加原酶液，使酶液在土壤中含量分別為1、2和4 mL/kg，土壤濕度為田間最大持水量的50%，異噁草松在土壤中的初始濃度為5 mg/L，設(shè)3次重復(fù)，每2 d加水補(bǔ)足，在30 ℃下放置，分別于0、1、3、5、10、15、20、30 d后檢測異噁草松含量，計算異噁草松降解率和半衰期。以添加相同濃度菌懸液的異噁草松土壤作為菌懸液處理，以不添加粗酶液和菌懸液的異噁草松土壤作為藥劑對照。

1.2.1.5異噁草松濃度對降解酶降解效果的影響

使異噁草松在土壤中的初始添加濃度分別為10、5和2.5 mg/L，土壤濕度為田間最大持水量的50%，設(shè)3次重復(fù)，每2 d加水補(bǔ)足。在30 ℃的條件下，向土壤中添加原酶液，使酶液在土壤中含量為2 mL/kg，分別于0、1、3、5、10、15、20、30 d后檢測異噁草松含量，計算異噁草松降解率和半衰期。以添加相同濃度菌懸液的異噁草松土壤作為菌懸液處理，以不添加粗酶液和菌懸液的異噁草松土壤作為藥劑對照。

1.2.1.6異噁草松降解率計算公式

1.2.1.7異噁草松降解動力學(xué)方程

降解菌酶降解異噁草松動力學(xué)方程采用一級動力學(xué)方程擬合：Ct=C0·e-kt(Ct：t時刻異噁草松殘留濃度，C0：異噁草松初始濃度，k：降解菌酶降解速率常數(shù))。

1.2.2 氣相色譜法檢測異噁草松含量

1.2.2.1氣相色譜分析條件

色譜柱：RTX-1701石英毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；柱溫：起始溫度200 ℃，保持4 min，以10 ℃/min升溫至220 ℃，保持4 min；進(jìn)樣量：1.0 μL；檢測器溫度：ECD檢測器，280 ℃；分流比：3.0；保留時間：10 min。

1.2.2.2異噁草松標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取10 mg異噁草松標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即為100 mg/L的母液。用移液槍分別取0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 mL用甲醇定容至100 mL，配制成濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用氣相色譜儀按上述色譜條件進(jìn)樣，測定各處理。異噁草松在0.01～10 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=80 608x-4 788.3，決定系數(shù)R2=0.997 3。

1.2.2.3土壤中樣品前處理方法

將土壤樣品裝入三角瓶中，每克樣品中加入3 mL乙酸乙酯-丙酮V乙酸乙酯∶V丙酮=9∶1混合溶劑，在振蕩器上振蕩2 h，抽濾提取，將提取液轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至1 mL，于室溫下用氮氣吹干儀吹干，無水硫酸銅脫水，用5 mL甲醇溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，待GC-ECD分析。

1.2.2.4土壤中異噁草松檢測體系的添加回收率

配制異噁草松標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L，混入自然風(fēng)干的土壤中，調(diào)節(jié)土壤濕度為田間最大持水量的50%，按1.2.2.3所述前處理方法進(jìn)行處理后，用氣相色譜檢測異噁草松含量，計算該方法的添加回收率。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析方法

試驗原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件處理完成，并應(yīng)用DPS軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著性比較采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件對異噁草松降解酶降解效果的影響

2.1.1 土壤中異噁草松檢測體系的添加回收率

如表1所示，異噁草松的添加回收率在81.5%～94.3%之間，變異系數(shù)為1.7%～6.7%，符合國家農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則(NY/T 788-2004)[18]要求。說明土壤中樣品前處理方法可行。

表1土壤中異噁草松添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

Table1Fortifiedrecoveryandrelativedeviationofclomazonefromsoils

添加濃度/mg·L-1Addedconcentration回收率/%Recoveryrate12345平均回收率/%Averagerecovery相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/%Relativestandarddeviation0．0191．983．476．874．780．681．56．70．0582．691．084．175．280．182．65．80．184．077．683．085．690．284．14．60．580．584．589．189．389．086．53．9193．088．889．892．983．489．63．9593．795．693．392．596．594．31．7

2.1.2 溫度對降解酶降解效果的影響

由圖1可知，隨著處理時間的延長，降解粗酶液對異噁草松的降解率逐漸增大，隨著溫度的增加，降解酶降解異噁草松的速度明顯提高，且差異顯著，溫度為25 ℃和30 ℃的降解效果好，且降解率的變化趨于一致。在試驗所設(shè)定溫度范圍內(nèi)，30 ℃條件下降解率最高，在第30天時可達(dá)到81.7%，與20 ℃低溫相比高出11.7%，而只比25 ℃的處理高出2.7%，說明溫度對降解酶的降解效果有顯著的影響。

通過對異噁草松殘留量的數(shù)據(jù)分析，計算得到不同溫度下的降解動力學(xué)方程及各項參數(shù)，如表2所示。由表2可知，溫度為30 ℃的處理下降解半衰期最短，僅為12.3 d，與20 ℃處理相比半衰期提高了4.2 d，而僅比25 ℃處理提前了1.4 d，因此推測在本試驗條件下降解酶的最適降解溫度為30 ℃。

圖1 溫度對降解酶降解效果的影響Fig.1 Effects of temperature on degradation by the enzyme

表2 不同溫度下降解酶降解異噁草松的動力學(xué)參數(shù)1)Table 2 Kinetic parameters of the biodegradation of clomazone by the enzyme at different temperatures

1)**表示相關(guān)性極顯著。 ** Indicates highly significant correlation.

2.1.3 土壤濕度對降解酶降解效果的影響

由圖2可知，在土壤濕度為50%時，降解酶對異噁草松的降解率明顯高于37.5%和62.5%條件下。在這3種條件下，降解率的變化趨于一致，均隨著時間的延長而增大，且差異顯著，并且第5 天降解率增加幅度最大，說明降解酶在添加5 d內(nèi)降解能力最強(qiáng)。在試驗所設(shè)定條件范圍內(nèi)，土壤濕度為50%時降解率最高，在第30 天時可達(dá)到81.2%，與37.5%和62.5%條件下相比分別高出11.2%和9.7%，說明土壤濕度對降解酶的降解效果有顯著的影響。

通過對異噁草松殘留量的數(shù)據(jù)分析，計算得到不同土壤濕度下的降解動力學(xué)方程及各項參數(shù)，如表3所示。由表3可知，土壤濕度為50%的處理下降解半衰期最短，僅為12.7 d，比37.5%和62.5%半衰期分別縮短了4.5 d和3.7 d，說明調(diào)節(jié)土壤濕度為50%時可以提高土壤中異噁草松的降解效果，縮短降解時間，即異噁草松降解酶的適宜降解土壤濕度為50%。

圖2 土壤濕度對降解酶降解效果的影響Fig.2 Effects of soil moisture on degradation by the enzyme

表3不同土壤濕度下降解酶降解異噁草松的動力學(xué)參數(shù)1)

Table3Kineticparametersofthebiodegradationofclomazonebytheenzymeunderdifferentsoilmoistureconditions

土壤濕度/%Soilmoisture回歸方程Regressionequation(Ct=C0e-kt)決定系數(shù)(R2)Determinationcoefficient速率常數(shù)(k)Rateconstant半衰期(T1/2)/dHalf?life37．5Ct=4．6775e-0．0404t0．9791??0．040417．250．0Ct=4．1311e-0．0545t0．9523??0．054512．762．5Ct=4．4662e-0．0422t0．9585??0．042216．4

1) **表示相關(guān)性極顯著。 ** Indicates highly significant correlation.

2.1.4 酶液添加量對降解酶降解效果的影響

由圖3可知，降解酶對異噁草松的降解率隨著時間的延長而增大，且差異顯著。隨著降解酶添加量的增加，降解酶對異噁草松的降解速度明顯提高，添加量為2～4 mL/kg的降解效果好，并且降解率的變化趨于一致。在試驗所設(shè)定條件范圍內(nèi)，酶液添加量為4 mL/kg時降解率最高，在第30天時可達(dá)到81.5%，與1 mL/kg的低添加量相比高出11.4%，而只比2 mL/kg的添加量高出1.4%，說明酶液添加量對降解酶的降解效果有顯著的影響，當(dāng)添加量大于2 mL/kg時降解效果提高不明顯。

圖3 酶液添加量對降解酶降解效果的影響Fig.3 Effects of enzyme addition on degradation by the enzyme

通過對異噁草松殘留量的數(shù)據(jù)分析，計算得到不同酶液添加量條件下的降解動力學(xué)方程及各項參數(shù)，如表4所示。從表4可知，添加量為4 mL/kg的處理下降解半衰期最短，僅為12.9 d，與1 mL/kg處理相比半衰期提高了3.9 d，而僅比2 mL/kg處理提前了0.3 d，說明適當(dāng)提高酶液添加量有縮短降解時間的效果，考慮到實際應(yīng)用成本的問題，則應(yīng)該在保證降解效果的同時選擇適當(dāng)?shù)奶砑恿?，因此在本試驗條件下異噁草松降解酶的適宜添加量為2 mL/kg。

表4不同酶液添加量下降解酶降解異噁草松的動力學(xué)參數(shù)1)

Table4Kineticparametersofthebiodegradationofclomazonebytheenzymeatdifferentenzymeadditiontreatments

酶液添加量/mL·kg-1Enzymeaddition回歸方程Regressionequation(Ct=C0e-kt)決定系數(shù)(R2)Determinationcoefficient速率常數(shù)(k)Rateconstant半衰期/dHalf?life(T1/2)1Ct=4．7322e-0．0412t0．9827??0．041216．82Ct=4．1310e-0．0524t0．9516??0．052413．24Ct=4．0634e-0．0539t0．9565??0．053912．9

1) **表示相關(guān)性極顯著。 ** Indicates highly significant correlation.

2.1.5 異噁草松濃度對降解酶降解效果的影響

由圖4可知，降解酶對異噁草松的降解率隨著時間的延長而增大，且差異顯著，隨著異噁草松初始添加濃度的增加，降解酶對異噁草松的降解速度提高，在這3種條件下，降解率的變化趨于一致，均于第5天降解率增加幅度最大，說明降解酶在添加5 d內(nèi)降解能力最強(qiáng)。在試驗所設(shè)定條件范圍內(nèi)，異噁草松初始添加濃度為10 mg/L時降解率最高，在第30天時可達(dá)到84.9%，與2.5 mg/L和5 mg/L的處理相比分別高出5.9%和4.4%，說明異噁草松初始添加濃度對降解酶的降解效果影響差異不顯著。

通過對異噁草松殘留量的數(shù)據(jù)分析，計算得到不同異噁草松初始添加濃度條件下的降解動力學(xué)方程及各項參數(shù)，如表5所示。如表5可知，添加量為10 mg/L的處理下降解半衰期最短，僅為11.2 d，分別只比2.5 mg/L和5 mg/L處理的半衰期縮短了2.0 d和1.8 d，說明異噁草松濃度高對降解酶的降解效果影響差異不顯著。

圖4 異噁草松濃度對降解酶降解效果的影響Fig.4 Effects of clomazone concentration on degradation by the enzyme

表5不同異噁草松濃度下降解酶降解異噁草松的動力學(xué)參數(shù)1)

Table5Kineticparametersofthebiodegradationofclomazonebytheenzymeatdifferentclomazoneconcentrations

異噁草松濃度/mg·L-1Clomazoneconcentration回歸方程Regressionequation(Ct=C0e-kt)決定系數(shù)(R2)Determinationcoefficient速率常數(shù)(k)Rateconstant半衰期/dHalf?life(T1/2)2．5Ct=2．2827e-0．0524t0．9750??0．052413．25Ct=4．1332e-0．0532t0．9503??0．053213．010Ct=8．0166e-0．0619t0．9507??0．061911．2

1) **表示相關(guān)性極顯著。 ** Indicates highly significant correlation.

2.1.6 異噁草松降解酶降解效果的研究

由圖5可知，降解酶和W2菌懸液的降解率隨著處理時間的增加而提高，但W2菌懸液和藥劑對照在5 d內(nèi)差異不顯著, 可能是由于菌生長繁殖較慢，分泌降解酶較少。添加降解酶和W2菌懸液后，異噁草松的降解速度明顯提高，30 d降解率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然降解，其中降解酶的降解能力優(yōu)于菌懸液降解能力。降解酶在降解30 d后降解率可達(dá)到81.7%，此時土壤中殘留濃度僅為0.916 mg/L，降解率與藥劑自然降解率相比增加了58.5%，比W2菌懸液的提高了31.0%。

通過對異噁草松殘留量的數(shù)據(jù)分析，計算得到降解酶、W2菌懸液和藥劑對照的降解動力學(xué)方程及各項參數(shù)，如表6所示。從表6可知，藥劑對照和W2菌懸液處理降解半衰期分別為80.6 d和29.2 d，降解酶的降解半衰期與藥劑對照和菌懸液相比分別提前了68.3 d和16.9 d，說明添加降解酶可以明顯提高土壤中異噁草松的降解速率。

圖5 降解酶對異噁草松的降解曲線Fig.5 Clomazone degradation curve by the enzyme

表6 降解酶對異噁草松的降解動力學(xué)參數(shù)1)Table 6 Kinetic parameters of the biodegradation of clomazone by the enzyme

1) **表示相關(guān)性極顯著。 ** Indicate highly significant correlation.

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度為30 ℃，土壤濕度為田間最大持水量的50%，原酶液(酶活力為1.066 μg/mL/min)添加量為2 mL/kg的條件下，30 d降解酶對異噁草松的降解率最大，為81.7%，與添加菌懸液處理和藥劑對照相比分別提高了31.0%和58.5%，降解半衰期(12.3 d)比菌懸液和藥劑對照分別縮短了16.9 d和68.3 d。異噁草松初始添加濃度對降解酶的降解效果影響差異不顯著。

在實驗室內(nèi)異噁草松降解酶的最適溫度為35 ℃，但因為東北地區(qū)夏天土壤表層溫度一般集中于30 ℃左右，而隨著土壤深度的增加溫度還會逐漸降低，故本研究土壤溫度范圍僅設(shè)置為20～30 ℃，其中30 ℃時降解酶的降解效果最好，可以為降解酶的田間實際應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。

除此之外，影響酶對農(nóng)藥生物修復(fù)的因素還有農(nóng)藥本身。本研究結(jié)果表明，當(dāng)異噁草松濃度為2.5、5、10 mg/L時，降解酶對其降解效果影響差異不顯著，但是這并不能完全反映底物濃度對異噁草松降解酶降解效果的影響，還應(yīng)該對高濃度或更低濃度的底物進(jìn)行酶降解試驗，從而獲得更準(zhǔn)確的反應(yīng)趨勢。

本研究在最適反應(yīng)條件下研究降解酶對異噁草松的降解作用。結(jié)果表明，5 d時降解率可達(dá)到42.0%，但是隨著時間的延長降解速度增加幅度減慢，說明降解酶活力逐漸降低，30 d時降解率為81.7%，顯著高于W2菌肥最適降解條件下的55.0%，直接應(yīng)用酶液僅可在短時間內(nèi)提高降解率。酶的性質(zhì)不穩(wěn)定，容易受到在環(huán)境中移動性差、被土壤吸附、微生物的蛋白酶降解等因素的影響而降低或失去活性，酶的固定化則可以很好地解決這個難題，即通過化學(xué)或物理方法將游離態(tài)酶固定在載體上，使其成為具有活力的、可重復(fù)使用的生物活性物[19-20]。但是將其固定化后，所用固定化試劑可能會阻礙底物與內(nèi)部有效降解成分的接觸，使降解酶的活力降低[21]。

本研究結(jié)果表明，異噁草松降解酶能夠快速高效地降解異噁草松，并且對酶促反應(yīng)的環(huán)境條件要求低，如果能夠提高降解酶的穩(wěn)定性，在農(nóng)藥污染的生物修復(fù)與治理方面將有更寬廣的前景。

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Comparativestudiesonthedegradationeffectsoftheclomazonedegradationenzymeunderdifferentconditions

Liu Yaguang,Liu Bing,Li Xiaoyu,Li Wei,Jing Qiuyue,He Fuli

(CollegeofAgriculture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

To validate the high efficiency of clomazone degradation by the bacterium W2, this study employed gas chromatography to determine the amount of clomazone.To determine the effects of the clomazone-degrading enzyme, four factors were studied, involving the temperature, the soil moisture, enzyme addition and clomazone concentration under indoor conditions.The results showed that the best degradation rate of clomazone was 81.7% after 30 d at 30 ℃, 50% of soil water content, 2 mL/kg enzyme and 1.066 μg/mL·min of enzyme activity, which was 31.0% and 58.5% higher than those of bacterial and reagent treatments, while the degradation half-life was 12.3 d, shortened by 16.9 d and 68.3 d, respectively.There were no significant effects at different clomazone concentrations on clomazone degradation by the enzyme.

clomazone; degradation enzyme; degradation effect

2013-04-24

： 2013-09-16

X 172, X 592

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.016

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