黑尾葉蟬精氨酸激酶和一個(gè)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆和發(fā)育表達(dá)特性研究

侯吉祥，孟盼盼，馬偉華，周 菲，林擁軍

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430070)

黑尾葉蟬精氨酸激酶和一個(gè)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆和發(fā)育表達(dá)特性研究

侯吉祥，孟盼盼，馬偉華，周 菲，林擁軍*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430070)

黑尾葉蟬(Nephotettixcincticeps)是一種能傳播病毒的水稻害蟲(chóng)，對(duì)水稻生產(chǎn)有著巨大的威脅。本文在黑尾葉蟬中克隆得到了一個(gè)精氨酸激酶基因(NcAK)和一個(gè)delta類型的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因(NcGST)，并對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行了序列分析和表達(dá)特性檢測(cè)。結(jié)果表明，NcAK包含的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 068 bp，編碼一個(gè)含356個(gè)氨基酸的蛋白。進(jìn)化研究表明該蛋白序列與玻璃翅葉蟬(Homalodiscavitripennis)的精氨酸激酶的序列親緣關(guān)系最近。Real-time結(jié)果表明NcAK在黑尾葉蟬的雄成蟲(chóng)中表達(dá)量高于在卵、1齡若蟲(chóng)、5齡若蟲(chóng)和雌成蟲(chóng)中的表達(dá)量。NcGST的開(kāi)放閱讀框由651個(gè)堿基組成，編碼一個(gè)包含217氨基酸的蛋白，進(jìn)化研究表明該蛋白與美國(guó)牧草盲蝽(Lyguslineolaris)GSTs編碼蛋白親緣關(guān)系最近。表達(dá)量檢測(cè)表明NcGST在5齡若蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng)中的表達(dá)量要高于在卵和1齡的表達(dá)量。

黑尾葉蟬； 精氨酸激酶； 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶

黑尾葉蟬[Nephotettixcincticeps(Uhler)]是一種主要分布在長(zhǎng)江中上游和西南各省的水稻害蟲(chóng)，它不僅通過(guò)吸取水稻汁液為害水稻，同時(shí)能夠傳播水稻黃矮病、水稻矮縮病等水稻病毒病，一旦病害暴發(fā)將對(duì)水稻產(chǎn)量造成極大的影響[1]。目前對(duì)黑尾葉蟬主要采用農(nóng)藥防治。但是由于農(nóng)藥的過(guò)量使用，黑尾葉蟬已經(jīng)對(duì)有機(jī)磷類和有機(jī)氯類農(nóng)藥產(chǎn)生了一定的抗藥性，需要尋找發(fā)展更安全高效的抗蟲(chóng)方法。

精氨酸激酶是僅存于無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的磷酸原激酶，主要功能是通過(guò)催化精氨酸和ATP之間的可逆反應(yīng)將能量存儲(chǔ)于磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中，磷酸精氨酸是昆蟲(chóng)肌肉中唯一有效形成ATP的磷酞基供體[2]。不僅如此，精氨酸激酶在甲殼動(dòng)物的免疫中也起著一定的作用[3]。目前已經(jīng)在多個(gè)物種中都得到了精氨酸激酶的cDNA序列[4-5]。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Glutathione-S-transferase (GSTs)是多個(gè)基因編碼、具有多種功能的超基因家族酶，分子量23～29 ku。根據(jù)亞細(xì)胞定位，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶可以分為微粒體型(microsomal GSTs)、線粒體型(mitochondrial GSTs)和胞質(zhì)型(cytosolic GSTs)三大類型。其中胞質(zhì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是研究最多的類型，通常所指的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶即為此類。昆蟲(chóng)胞質(zhì)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶包括omega、sigma、theta、zeta、delta和epsilon 6個(gè)已知的家族[6]。其中delta家族和epsilon家族是昆蟲(chóng)生物體特有的家族。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶對(duì)昆蟲(chóng)的對(duì)農(nóng)藥的敏感性降低有著重要的意義。研究表明，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑尤其是二甲基膦酸酯和二甲基硫代膦酸酯的代謝中起著相當(dāng)重要的作用，對(duì)保棉磷、碘甲烷、3,4-二氯硝基苯也都表現(xiàn)出很高的代謝活性[7]。在對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥有抗性的德國(guó)小蠊(BlattellagermanicaLinnaeus)的研究中，吳剛等證明抗性品系德國(guó)小蠊的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶酶活力相對(duì)于敏感品系明顯提高[8]。Zhu等發(fā)現(xiàn)GSTs抑制劑能夠降低美國(guó)牧草盲蝽對(duì)農(nóng)藥原料1-氯-2,4-二硝基苯和馬拉硫磷的抗性[9]，提高農(nóng)藥對(duì)盲蝽的致死率。目前已經(jīng)有研究表明黑尾葉蟬對(duì)敵敵畏等有機(jī)磷農(nóng)藥具有很高的抗藥性[10]，而GSTs對(duì)于有機(jī)磷類和有機(jī)氯農(nóng)藥在昆蟲(chóng)體內(nèi)的代謝中起著很重要的作用，因此研究黑尾葉蟬的GSTs對(duì)研究黑尾葉蟬的解毒能力有著重要的意義。本文克隆了一個(gè)編碼黑尾葉蟬的精氨酸激酶的NcAK基因和一個(gè)編碼黑尾葉蟬谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的NcGST基因的CDS序列，對(duì)序列進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析, 并檢測(cè)它們mRNA的表達(dá)特性，為以后深入研究精氨酸激酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在黑尾葉蟬體內(nèi)的表達(dá)調(diào)控及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的解毒機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

黑尾葉蟬于2009年8月采集于江西南昌，然后于本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用水稻感蟲(chóng)品種‘TN1’保存。培養(yǎng)條件為：溫度(26±2)℃，相對(duì)濕度50%，光照周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 材料

限制性內(nèi)切酶、Taq酶、TA克隆試劑盒、Trizol試劑、DEPC為上海生工產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Roche公司；特異引物由武漢安基生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成

取黑尾葉蟬在液氮中研磨成粉末，用Trizol 試劑盒提取總RNA，用DNA酶消化痕量DNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成第一鏈cDNA。

1.3.2 基因的擴(kuò)增

設(shè)計(jì)NcAK和NcGST的擴(kuò)增引物見(jiàn)表1，以黑尾葉蟬的cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，32 個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃ 7 min。

表1NcAK和NcGST的擴(kuò)增引物序列

Table1TheprimersofNcAKandNcGST

引物名稱Primername引物序列Primersequence(5′→3′)NcAKFCTCCTAGCGTCACTCCGTTCNcAKRTGAAAATAGGAGCCGCCGTGNcGSTFCTGATGCGTAGTGAGGTGTGANcGSTRTGCAGTCACTTCGGTTGTGT

1.3.3 基因的克隆與測(cè)序

取4μL 的PCR產(chǎn)物，用p-EASY T3 clone kit進(jìn)行TA克隆；從藍(lán)白斑平板中挑取單個(gè)白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，重組質(zhì)粒用EcoR I 酶切鑒定，選擇其中4個(gè)陽(yáng)性克隆，用引物SP6/T7測(cè)序。

1.3.4 序列分析、同源性分析和進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用DNAman軟件對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行翻譯，利用軟件DNAman對(duì)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用NCBI在線工具Conserved Domains Search(www.ncbi.nlm.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的搜索。利用NCBI在線工具Blastx對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行同源基因的尋找。采用Mega5.0軟件的鄰接法(NJneighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化距離分析的P-distance模型，系統(tǒng)樹(shù)每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以bootstrap 進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1 000 次。

1.4 NcAK和NcGST的表達(dá)特性研究

分別提取不同發(fā)育階段和性別黑尾葉蟬(24 h內(nèi)產(chǎn)下的蟲(chóng)卵、24 h內(nèi)蛻皮的1齡若蟲(chóng)、5齡若蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng))的總RNA，取2 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板，再設(shè)計(jì)引物(表2)，檢測(cè)基因表達(dá)量。使用TaKaRa公司的real-time試劑盒20 μL體系。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；然后95 ℃ 35 s，60 ℃36 s。共40個(gè)循環(huán)；利用Excel軟件使用 2-△△Ct法將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用SPSS軟件中Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

表2NcAK和NcGST的RT引物序列

Table2TheprimersforRT-PCRofNcAKandNcGST

引物名稱Primername引物序列Primersequence(5′→3′)NcAKRTFTCATTAAGATTGAGCGAGAANcAKRTRTGTAGTCGGTTCTGTCTTNcGSTRTFTTCTTCTTCTTCTCTTCATCNcGSTRTRAACCAGAGGCTATACTTC

2 結(jié)果與分析

2.1 NcAK和NcGST序列分析

擴(kuò)增得到兩條長(zhǎng)度分別為799 bp和1 144 bp的cDNA片段,NcAK基因的開(kāi)放閱讀框由1 068個(gè)堿基組成，編碼356個(gè)氨基酸，分子量為 40 134.59，推測(cè)蛋白序列等電點(diǎn)為5.98。NcGST的開(kāi)放閱讀框由651個(gè)堿基組成，編碼217個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白序列分子量為24 168.7，等電點(diǎn)為6.74。其核酸序列及按三聯(lián)密碼子推導(dǎo)出的氨基酸序列見(jiàn)圖1和圖2。用NCBI在線工具 Conserved Domains Search(www.ncbi.nlm.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)NcAK具有精氨酸激酶的保守結(jié)構(gòu)域，NcGST具有delta和epsilon類型的GSTs保守結(jié)構(gòu)域。BlastX比對(duì)分析顯示，NcAK基因推測(cè)編碼蛋白與其他物種的精氨酸激酶蛋白序列相似性高達(dá)90%～97%，而NcGST基因推測(cè)編碼蛋白與其他物種GSTs基因蛋白序列相似性達(dá)到60%～74%，其中與delta類型的GSTs基因相似程度最高。因此推測(cè)，NcAK基因編碼精氨酸激酶而NcGST基因編碼一個(gè)delta類型的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶。

圖1 NcAK的開(kāi)放閱讀框推測(cè)得到的蛋白序列Fig.1 The ORF and the deduced protein of NcAK

圖2 黑尾葉蟬谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶NcGST的開(kāi)放閱讀框和推測(cè)得到蛋白序列Fig.2 The ORF and the deduced protein of NcGST

2.2 序列的同源性分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

為了解NcAK和NcGST與其他物種精氨酸激酶和GSTs的親緣關(guān)系，利用Mega5.0軟件NcAK和NcGST預(yù)測(cè)的蛋白序列與其他物種同源蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果(圖3和圖4)顯示，在選取的昆蟲(chóng)物種中NcAK與玻璃翅葉蟬(Homalodiscavitripennis)的精氨酸激酶和葉蟬(OncometopianigricansWalker)的精氨酸激酶同緣關(guān)系最近。而NcGST與半翅目的美國(guó)牧草盲蝽(LyguslineolarisGoeze)、半翅目的白背飛虱(SogatellafurciferaHorváth)和褐飛虱(NilaparvatalugensSt?l)的GSTs親緣關(guān)系最近。

2.3 基因表達(dá)特性研究

以核蛋白L19為內(nèi)參，檢測(cè)了NcAK和NcGST在黑尾葉蟬24 h內(nèi)產(chǎn)的卵，24 h內(nèi)蛻皮產(chǎn)生的1齡和5齡若蟲(chóng)以及雌雄成蟲(chóng)中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NcAK基因在黑尾葉蟬的幾個(gè)齡期中都有表達(dá)，在雄成蟲(chóng)的表達(dá)量最高,差異性顯著(P<0.05)，在其他齡期表達(dá)量差異不大。而NcGST在5齡若蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng)中的表達(dá)量要高于在卵中和1齡若蟲(chóng)中的表達(dá)量。

3 討論

本研究克隆得到了黑尾葉蟬精氨酸激酶的CDS序列,并進(jìn)行了序列分析和表達(dá)特性研究。經(jīng)過(guò)序列分析和同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，NcAK推測(cè)得到的蛋白序列和其他昆蟲(chóng)中得到的精氨酸激酶蛋白序列氨基酸一致性高達(dá)80% ～ 97%。這證明克隆得到的確實(shí)是精氨酸激酶，氨基酸相似性高度一致說(shuō)明精氨酸激酶在進(jìn)化中是高度保守的。這也證明了該基因的重要性。表達(dá)量檢測(cè)表明，該基因在黑尾葉蟬的不同齡期都有表達(dá)，在雄成蟲(chóng)中表達(dá)量最高，和其余齡期差異顯著(P<0.05)，這也許與雄成蟲(chóng)的發(fā)育特性有關(guān)。在其余的齡期中表達(dá)量差異不顯著。這表明NcAK的表達(dá)在成蟲(chóng)中表現(xiàn)出了性別差異而沒(méi)有表現(xiàn)出不同齡期之間的差異。部分昆蟲(chóng)如家蠶存在精氨酸表達(dá)量隨齡期的增加而增加的現(xiàn)象[4]，這也許與家蠶是完全變態(tài)昆蟲(chóng)而黑尾葉蟬不是完全變態(tài)昆蟲(chóng)有關(guān)。

人們已經(jīng)以精氨酸激酶為靶標(biāo)進(jìn)行了大量抗蟲(chóng)研究，徐秀鳳等利用飼喂以精氨酸激酶為靶標(biāo)的dsRNA的方式提高了小菜蛾(PlutellaxylostellaLinnaeus)的死亡率[11]。蘇曉峰等發(fā)現(xiàn)利用RNAi的方法沉默精氨酸激酶基因可以有效延緩棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育[12]。而在黃曲條跳甲(PhyllotretastriolataFabricius)精氨酸激酶的研究中，Zhao通過(guò)RNAi方式沉默精氨酸激酶的表達(dá)，結(jié)果提高了黃曲條跳甲的死亡率，并降低了雌性黃曲條跳甲的產(chǎn)卵量[13]。這些試驗(yàn)證明，以精氨酸激酶為靶標(biāo)進(jìn)行抗蟲(chóng)是一種可行的方式。在黑尾葉蟬的抗蟲(chóng)研究中，NcAK可以作為備選的抗蟲(chóng)靶標(biāo)。

圖3 精氨酸激酶蛋白質(zhì)序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of the deduced protein of NcAK and homologous gene sequences

本試驗(yàn)分離得到了黑尾葉蟬谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因NcGST的CDS序列，利用NCBI在線工具 Conserved Domains Search(www.ncbi.nlm.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)得到該基因編碼的蛋白擁有delta類型的NcGST的結(jié)構(gòu)域，推測(cè)NcGST是delta類型的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因。預(yù)測(cè)的NcGST蛋白序列和美國(guó)牧草盲蝽內(nèi)得到的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的氨基酸有74%的相似性。美國(guó)牧草盲蝽內(nèi)的GSTs具有解毒功能，由此推測(cè)NcGST也有類似功能。檢測(cè)表明NcGST在卵和1齡若蟲(chóng)中表達(dá)量與在5齡若蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng)中表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。由此可以推測(cè)，黑尾葉蟬對(duì)有機(jī)磷和有機(jī)氯類農(nóng)藥的敏感性會(huì)隨著齡期的增加而降低，這在之前未見(jiàn)報(bào)道。而黑尾葉蟬對(duì)吡蟲(chóng)啉、阿維菌素和噻嗪酮的敏感性變化中據(jù)報(bào)道有類似趨勢(shì)，林雪梅等發(fā)現(xiàn)，隨著齡期的增長(zhǎng)，黑尾葉蟬對(duì)吡蟲(chóng)啉、阿維菌素的敏感性會(huì)降低[14]，在其他昆蟲(chóng)已經(jīng)證明GSTs的活性與這兩種農(nóng)藥在昆蟲(chóng)體內(nèi)的代謝有關(guān)[15-16]，所以這種現(xiàn)象也許與NcGST的表達(dá)量增加有關(guān)，推測(cè)NcGST對(duì)這類殺蟲(chóng)劑也有解毒能力。黑尾葉蟬對(duì)噻嗪酮的敏感性同樣也隨著齡期的增加而降低，但是在褐飛虱抗性品系的研究中林友偉發(fā)現(xiàn)GSTs的活性與這種敏感性的降低無(wú)關(guān)[17]。黑尾葉蟬對(duì)噻嗪酮敏感性的降低可能有其他原因，需要進(jìn)一步研究。

現(xiàn)在昆蟲(chóng)對(duì)農(nóng)藥的敏感性越來(lái)越低，發(fā)展安全高效的抗蟲(chóng)策略已經(jīng)迫在眉睫。本次研究中克隆到了黑尾葉蟬的精氨酸激酶和一個(gè)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的CDS，分析了其序列特征和表達(dá)特征，為以后對(duì)黑尾葉蟬的研究提供了有用的信息，同時(shí)也為以后的抗蟲(chóng)研究打下了基礎(chǔ)。

圖4 NcGST及其同源基因蛋白質(zhì)序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of the deduced protein of NcGST and homologous gene sequences

圖5 NcAK在不同齡期的表達(dá)量Fig.5 The expression levels of NcAK during different stage

圖6 NcGST在不同齡期的表達(dá)量Fig.6 The expression levels of NcGST during different stage

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CloningandexpressionprofilesofargininekinaseandGSTsofNephotettixcincticeps

Hou Jixiang，Meng Panpan，Ma Weihua，Zhou Fei,Lin Yongjun

(NationalKeyLaboratoryofCropGeneticImprovementinWuhan,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

The green leafhopperNephotettixcincticepsis a rice insect that can transmit plant viruses.We cloned and analyzed an arginine kinase gene namedNcAKand a delta class GSTs gene namedNcGSTinNephotettixcincticeps.NcAKcontained an open reading frame (ORF) of 1 068 bp in length, and encodes a protein of 356 amino acids.Phylogenetic analysis showed that the deduced protein ofNcAKwas closely related to the arginine kinase ofHomalodiscavitripennisandOncometopianigricans.The real-time PCR results indicated that theNcAKwas expressed higher in male adults than in the eggs, 1st instars, 5th instars, and female adults.NcGST, 899 bp in length, contained an ORF of 651 bp and encoded a protein of 217 amino acids.Phylogenetic analysis showed that the deduced protein ofNcGSTwas closely related to the GSTs ofLyguslineolaris.The real-time PCR results indicated thatNcGSTwas expressed higher in 5th instars, male adults and female adults than in eggs and 1st instars.

Nephotettixcincticeps; arginine kinase; glutathione-S-transferase

2013-05-17

： 2013-06-08

國(guó)家重大科技專項(xiàng)(2011ZX08001-001)

S 433.3

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.014

* 通信作者 E-mail:yongjunlin@mail.hzau.edu.cn