小麥品種抗條銹病基因Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的分子檢測(cè)

張玉薇，劉 博，劉太國(guó)*，高 利，陳萬(wàn)權(quán)*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201；2.植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

小麥品種抗條銹病基因Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的分子檢測(cè)

張玉薇1，2，劉 博2，劉太國(guó)2*，高 利2，陳萬(wàn)權(quán)2*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201；2.植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

利用抗條銹病基因Yr10、Yr18以及1BL/1RS易位的SCAR或STS標(biāo)記，對(duì)2006-2010年75份國(guó)家審定的小麥品種進(jìn)行了分子檢測(cè)，以明確Yr10、Yr18以及1BL/1RS易位在我國(guó)2006-2010年審定小麥品種資源中的分布。結(jié)果顯示：75份材料中有13份檢測(cè)到Y(jié)r10基因的標(biāo)記，1份檢測(cè)到Y(jié)r18基因的標(biāo)記，分別占參試材料的17.3%和1.3%，只有‘西農(nóng)928’能同時(shí)檢測(cè)到Y(jié)r10和Yr18基因；25份含有1BL/1RS易位片段，占參試材料的33.3%。表明1BL/1RS易位在我國(guó)小麥育種中利用率仍然較高，對(duì)目前流行條銹菌小種有良好抗性，而表現(xiàn)慢銹性的Yr18在小麥育種的利用率較低，建議在我國(guó)小麥育種中加強(qiáng)利用。

小麥； 分子標(biāo)記； 抗條銹病基因； 1BL/1RS易位。

小麥?zhǔn)鞘澜缟峡偖a(chǎn)量?jī)H次于玉米的第二大糧食作物，而我國(guó)是世界小麥第一大生產(chǎn)國(guó)，小麥產(chǎn)量在世界小麥總產(chǎn)量中占有重要比重[1]。2012年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織發(fā)布的《農(nóng)作物前景和糧食形勢(shì)》報(bào)告中指出，我國(guó)小麥產(chǎn)量預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)為1.174億t，約占世界小麥產(chǎn)量的17%[2]。近年來(lái)，隨著全球氣候變暖等氣候條件的變化，小麥條銹病呈流行趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)[3]。選育并推廣抗病品種為防治小麥條銹病最為經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法[4]。

分子標(biāo)記是一項(xiàng)發(fā)展迅速的生物技術(shù)，常用于分子輔助選擇育種和快速檢測(cè)特定目標(biāo)性狀基因。它以DNA形式直接表現(xiàn)，不受環(huán)境和待測(cè)品種的基因表達(dá)情況的限制[5]。祁旭升[6]、楊文雄[7]、王欣[8]、曹世勤[9]等眾多專家學(xué)者曾利用分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)小麥品種的抗條銹基因進(jìn)行研究分析，證實(shí)了分子標(biāo)記在小麥品種抗條銹基因研究中有重要應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)已被廣泛使用。

Yr10最早由Metzger等[10]在小麥種質(zhì)P.I.178383中發(fā)現(xiàn)，是位于小麥1B染色體上的顯性抗病基因，對(duì)中國(guó)目前出現(xiàn)的大部分條銹菌生理小種都具有良好抗性[11]。邵映田等[12]利用AFLP方法成功地找到了與Yr10緊密連鎖的分子標(biāo)記，并轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記SC200，該SCAR標(biāo)記與Yr10的連鎖距離為0.5 cM。Yr18是成株抗性基因，與Lr34和Pm38緊密連鎖，慢條銹性表現(xiàn)穩(wěn)定，具有一定的利用價(jià)值[13]。引物sclv34為Yr18的共顯性標(biāo)記，具有準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好等特點(diǎn)。該標(biāo)記與Yr18的連鎖距離為2.5 cM[14]，可用于小麥品種Yr18分子標(biāo)記的輔助選育，Lagudah等[14]、Kolmer等[15]、祁旭升等[6]學(xué)者先后利用sclv34對(duì)各地小麥種質(zhì)進(jìn)行了抗條銹基因Yr18的分子檢測(cè)。楊文雄等[14]研究表明，我國(guó)農(nóng)家品種中Lr34/Yr18分布相當(dāng)廣泛，但在育成品種中只有‘南大2419’、‘內(nèi)鄉(xiāng)5號(hào)’等少數(shù)品種含有Lr34/Yr18。

1BL/1RS易位系源于黑麥，具有良好的抗逆性、適應(yīng)性和豐產(chǎn)性，是外緣種質(zhì)用于小麥育種最成功的范例[16]。國(guó)際玉米小麥改良中心(CIMMYT)約45%的高代品系屬于該易位類型[17]。1BL/1RS易位片段上帶有抗條銹、稈銹、葉銹和白粉病的基因(Yr9、Sr31、Lr26和Pm8)，曾作為小麥真菌病害的抗源在育種工作中起重要作用[18]。

本研究利用小麥Yr10、Yr18基因和1BL/1RS的SCAR或STS分子標(biāo)記，對(duì)2006-2010年我國(guó)國(guó)審小麥品種的75份材料進(jìn)行檢測(cè)，以了解這些基因和1BL/1RS易位片段在我國(guó)國(guó)審小麥品種中的分布，為小麥品種改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試75份小麥品種來(lái)自于2006-2010年國(guó)家審定小麥品種，陽(yáng)性對(duì)照材料為‘Avocet S*6/Yr10’、‘Avocet S*6/Yr18’以及攜帶1BL/1RS易位片段的‘Avocet S*6/Yr9’近等基因系，陰性對(duì)照材料為‘Avocet S’、‘銘賢169’。其中Avocet S系列由澳大利亞悉尼大學(xué)植物育種所培育，所有小麥品種均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥類病害組收集、繁存。

1.2 引物序列的合成

Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的STS或SCAR分子標(biāo)記引物(表1)由上海生工生物工程有限公司合成。

表1引物序列

Table1Primersequences

檢測(cè)目標(biāo)Target引物名稱Primername引物序列(5′?3′)Primersequence(5′?3′)退火溫度/℃Annealingtemperature參考文獻(xiàn)Reference1BL/1RSAF1AF4GGAGACATCATGAAACATTTGCTGTTGTTGGGCAGAAAG60Francisetal[19]Yr10SC200FSC200RCTGCAGAGTGACATCATACATCGAACTAGTAGATGCTGGC60Shaoetal[12]Yr18sclv34Fsclv34RGTTGGTTAAGACTGGTGATGGTGCTTGCTATTGCTGAATAGT60Lagudahetal[14]

1.3 基因組DNA的提取

采用CTAB方法[20-22]提取小麥葉片DNA，使用Nano Drop(ND-1000)測(cè)定DNA濃度，并稀釋至終濃度30 ng/μL。

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為10 μL，包含6 μL 2×TaqPlus PCR Master Mix，每條引物(5 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA(30 ng/μL)90 ng。其中Yr10的反應(yīng)程序[21]為：94 ℃變性3 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。Yr18的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。1BL/1RS的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性3 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色后在UVI pro紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Yr10和Yr18的分子檢測(cè)及其分析

邵映田等[12]研究表明，Yr10的引物SC200在含Yr10的品種上能檢測(cè)出200 bp和180 bp兩條帶，不含Yr10的品種只能檢測(cè)出180 bp一條帶。本試驗(yàn)應(yīng)用SCAR標(biāo)記對(duì)部分供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在近等基因系‘Avocet S*6/Yr10’上能檢測(cè)出200 bp和180 bp兩條帶，感病品種‘銘賢169’只能檢測(cè)出180 bp一條帶。75份材料中，‘新麥26’、‘蘇育麥1號(hào)’等13份品種能夠檢測(cè)出200 bp和180 bp兩條帶，推測(cè)這些品種含有Yr10基因，約占檢測(cè)樣本的16.0%。其余57份材料均檢測(cè)到非抗性標(biāo)記帶，推測(cè)這些品種不含Yr10基因。其中，‘周麥22’的檢測(cè)結(jié)果與董淑靜等[23]檢測(cè)結(jié)果一致。所有供試材料Yr10基因的分子檢測(cè)結(jié)果見表2。

圖1 部分供試小麥品種的Yr10 SCAR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR detection of Yr10 by SCAR marker in partial tested wheat cultivars

Kolmer[15]等研究表明，利用引物sclv34對(duì)小麥抗條銹病基因Yr18進(jìn)行分子檢測(cè)，在近等基因系‘Avocet S*6/Yr18’上能擴(kuò)增出150 bp的特征條帶，感病品種‘Avocet S’能擴(kuò)增出229 bp的片段。本試驗(yàn)應(yīng)用引物sclv34對(duì)供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖2)，在陰性對(duì)照‘銘賢169’上不能擴(kuò)出任何片段，在陽(yáng)性對(duì)照品種‘Avocet S*6/Yr18’和陰性對(duì)照‘Avocet S’的擴(kuò)增條帶與上述研究一致。在全部待測(cè)品種中，僅有‘西農(nóng)928’擴(kuò)出擴(kuò)增出150 bp的片段，推測(cè)‘西農(nóng)928’含有Yr18，占檢測(cè)品種的1.3%；其余74份材料未擴(kuò)增出特征條帶，推測(cè)這些品種中均不含有Yr18基因。

圖2 部分供試小麥品種的Yr18 SCAR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR detection of Yr18 by SCAR marker in partial tested wheat cultivars

2.2 1BL/1RS易位的分子檢測(cè)及其分析

根據(jù)之前的研究結(jié)果[9，19]，1BL/1RS易位的SCAR引物AF1/AF4能擴(kuò)增出1.5 kb的抗性標(biāo)記帶。圖3可以看出，陽(yáng)性對(duì)照‘Avocet S*6/Yr9’能擴(kuò)出1.5 kb的條帶，陰性對(duì)照‘Avocet S’不能擴(kuò)出此條帶。75份材料中，‘石麥15號(hào)’、‘京冬17’等24份材料能擴(kuò)出1.5 kb的特征帶，推測(cè)這些小麥品種含有1BL/1RS易位片段，約占檢測(cè)樣本的33.3%。所有供試材料1BL/1RS易位片段的分子檢測(cè)結(jié)果見表2。

系譜分析得知，‘京花9號(hào)’、‘石麥19’、‘京冬17’、‘京冬18’均為‘洛夫林10’的后代，它們的1BL/1RS易位可能來(lái)自‘洛夫林10’；‘邢麥6號(hào)’和‘邯麥13號(hào)’的1BL/1RS易位來(lái)自‘山前麥’；‘山農(nóng)優(yōu)麥2號(hào)’的親本含有‘牛朱特’，它的1BL/1RS易位可能來(lái)自‘牛朱特’。

圖3 部分供試小麥品種1BL/1RS易位的STS標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR detection of 1BL/1RS translocation by STS in partial tested wheat cultivars

表2 75份小麥品種的Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的分子檢測(cè)1)Table 2 Molecular detection results of Yr10 and Yr18 and 1BL/1RS translocation in 75 wheat cultivars

續(xù)表2Table2(Continued)

編號(hào)No．品種Cultivar品種來(lái)源Cultivarorigin選育省市Place檢測(cè)結(jié)果Detectionresults1BL/1RSYr10Yr1837淮麥29淮麥20/綿陽(yáng)04254江蘇+--38浚麥99?798264/豫麥52河南鶴壁-+-39鄭育麥9987豫麥21/豫麥2號(hào)∥豫麥57河南鄭州+--40輪選988矮敗小麥輪回選擇群體河南新鄉(xiāng)---41新麥21偃展1號(hào)/新麥9號(hào)河南新鄉(xiāng)---42山農(nóng)17L156/萊州137山東泰安---43冀5265冀5006/9204河北+--44邯麥13號(hào)山農(nóng)太91136/冀麥36河北邯鄲+--45石麥19號(hào)石4185∥(煙輻188/臨8014)F2河北石家+--46河農(nóng)6049石6021/河農(nóng)91459河北+--47洛旱11豫麥25號(hào)/山農(nóng)45河南洛陽(yáng)+--48山農(nóng)優(yōu)麥2號(hào)PH85?115?2∥79401/魯麥11號(hào)山東++-49洛旱9號(hào)豫麥49/山農(nóng)45河南洛陽(yáng)+--50洛旱13洛旱2號(hào)/晉麥47河南洛陽(yáng)---51河農(nóng)825臨遠(yuǎn)95?3019/石4185河北+--52綿麥3671275?1/99?1522四川---53揚(yáng)麥20揚(yáng)麥10號(hào)/揚(yáng)麥9號(hào)江蘇---54南農(nóng)0686MV964091/寧麥9號(hào)江蘇---55山農(nóng)19(83(3)?113/1604)F3∥886059山東-+-56山農(nóng)20PH82?2?2/954072山東---57新麥26新麥9408/濟(jì)南17河南新鄉(xiāng)-+-58蘇育麥1號(hào)煙1668/魯麥21號(hào)江蘇連云港-+-59鄭麥9962豫麥18/Ta971832河南+--60魯墾麥9號(hào)徐9935/煙優(yōu)361山東---61郯麥98濟(jì)寧13/942山東---62運(yùn)旱618運(yùn)旱92?18/新春9號(hào)山西---63滄麥6005臨汾6154/321?4?6河北滄州---64保麥10號(hào)石4185/96Y6河北保定---65京冬18F404/(長(zhǎng)豐1/ore∥雙82?4/81?142)∥931北京+--66中麥415貴農(nóng)11/京411∥京411北京---67克旱20克89?46/Cundo黑龍江---68遼春18號(hào)遼春10號(hào)變異株系選遼寧---69遼春20號(hào)鐵春2號(hào)/8452遼寧-+-70航麥96號(hào)遼春10號(hào)變異株系選遼寧-+-71巴豐5號(hào)永1087∥Y2008?6/巴麥10號(hào)內(nèi)蒙古+--72晉春15號(hào)YecorarF70/晉春9號(hào)山西---73隴春27號(hào)8858?2/隴春8號(hào)甘肅+--74高原412高原602/181∥臨汾5309青海-+-75赤麥7號(hào)B37/94?5內(nèi)蒙古赤峰-+-

1) + 表示存在；-表示不存在。 + Indicate presence，-indicate absence.

3 討論與結(jié)論

3.1 分子檢測(cè)的有效性及準(zhǔn)確性分析

近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)操作方便，且檢測(cè)不受季節(jié)和環(huán)境條件的影響，因而在小麥抗條銹遺傳研究中發(fā)掘基因緊密連鎖的DNA標(biāo)記，并通過(guò)標(biāo)記輔助選擇育成了一批有價(jià)值的種質(zhì)。試驗(yàn)中采用的分子標(biāo)記SC200與Yr10緊密連鎖，與Yr10遺傳距離為0.5 cM[12]；引物sclv34為Yr18的共顯性標(biāo)記，與Yr18遺傳距離為2.5 cM[15]，兩個(gè)分子標(biāo)記與基因間的遺傳距離均小于3 cM，因此檢測(cè)結(jié)果有重要參考價(jià)值。在75個(gè)品種的分子檢測(cè)中，只有‘西農(nóng)928’同時(shí)檢測(cè)到Y(jié)r10、Yr18基因的標(biāo)記位點(diǎn)，建議加快推廣利用。1BL/1RS易位系是由黑麥染色體1R的短臂上通過(guò)染色體易位轉(zhuǎn)入普通小麥1B染色體上形成的，而本試驗(yàn)選用了Francis[18]等研究的黑麥染色體臂1BL/1RS易位的引物AF1/AF4為探針，提高了分子檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

3.2 各地待測(cè)品種中基因Yr10、Yr18的利用情況

Yr10對(duì)我國(guó)目前流行的條銹菌小種具有良好的抗性，王鳳樂(lè)等[24]對(duì)我國(guó)綿陽(yáng)系小麥抗條銹病調(diào)查表明，Yr10對(duì)中國(guó)近年來(lái)的優(yōu)勢(shì)生理小種條中30和條中31號(hào)表現(xiàn)免疫，井長(zhǎng)勤等[25]對(duì)我國(guó)重要小麥品種抗條銹基因的分析中未能找到含有Yr10品種。從本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果可以看出，我國(guó)國(guó)審小麥品種中含Yr10的品種占檢測(cè)品種的17.3%，主要分布在河南，有4個(gè)小麥品種，分別是‘周麥22號(hào)’、‘周麥23號(hào)’、‘浚麥99-7’、‘新麥26’，占所有Yr10品種的20.1%；其次是山東和遼寧，均占有10.5%，分別是‘山農(nóng)優(yōu)麥2號(hào)’、‘山農(nóng)19’和‘遼春20號(hào)’、‘航麥96號(hào)’；再者，陜西的‘西農(nóng)928’，青海的‘高原412’，內(nèi)蒙古的‘赤麥7號(hào)’，安徽的‘皖麥52號(hào)’，江蘇的‘蘇育麥1號(hào)’均檢測(cè)出含有Yr10基因?？傮w看來(lái)，Yr10基因在目前中國(guó)的國(guó)審小麥品種中很少被利用，有的小麥生產(chǎn)大省如來(lái)自河北的選育品種中未檢測(cè)到Y(jié)r10，因此，為更好地防治小麥條銹病，應(yīng)加強(qiáng)抗銹性表現(xiàn)良好的抗性基因Yr10在小麥育種上的利用。

李在峰等[26]研究發(fā)現(xiàn)成株抗性基因Yr18在生產(chǎn)上應(yīng)用可減少條銹病毒性生理小種的危害。楊文雄等[7]對(duì)我國(guó)234份育成品種檢測(cè)中僅有14份材料攜帶Yr18。本試驗(yàn)中75個(gè)待測(cè)品種中僅有一個(gè)品種即陜西的‘西農(nóng)928’檢測(cè)出Yr18。說(shuō)明在我國(guó)小麥育種中，基因Yr18的利用率比較低，因此，在以后的育種中，可以利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，加大對(duì)基因Yr18等慢銹基因的有效利用，提高品種的抗性水平。

3.3 1BL/1RS品種的分布情況及其原因

從抗性基因在生產(chǎn)品種中出現(xiàn)的頻率看，在當(dāng)前生產(chǎn)上的小麥品種中所具有的抗條銹基因以Yr9所占比例最大，這與中國(guó)小麥品種1BL/1RS易位系的利用有關(guān)[27]。70年代初，我國(guó)從羅馬尼亞引入了一些含有1BL/1RS易位系小麥品種如‘洛夫林10號(hào)’、‘洛夫林13’、‘洛夫林18’、‘山前麥’、‘高加索’、‘阿芙樂(lè)爾’等作為我國(guó)小麥育種的骨干親本[28]。本試驗(yàn)中1BL/1RS易位系占有33.3%，主要分布在河北，包括‘石麥15號(hào)’、‘邢麥6號(hào)’、‘金禾9123’、‘冀5265’等8個(gè)品種，占所有1BL/1RS品種的32%，河南占有28%，包括‘金麥8號(hào)’、‘漯麥9號(hào)’、‘洛旱11’、‘許科1號(hào)’等7個(gè)品種；其次是北京占有16%，江蘇占有12%，它們分別是‘京冬17’、‘京冬22’、‘京花9號(hào)’、‘京冬18’和‘淮麥21’、‘淮麥28’、‘淮麥29’；另外，山東的‘山農(nóng)優(yōu)麥2號(hào)’，內(nèi)蒙古的‘巴豐5號(hào)’，甘肅的‘隴春27號(hào)’也檢測(cè)出有1BL/1RS易位。隨著1BL/1RS品種被大量利用，其品種已逐漸對(duì)新的生理小種喪失了抗性，并且1BL/1RS小麥品種加工的面團(tuán)耐揉性弱、面團(tuán)發(fā)黏，面團(tuán)品質(zhì)變劣[29]。因此1BL/1RS品種在育種選擇親本時(shí)謹(jǐn)慎使用。

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MoleculardetectionofYr10andYr18genesand1BL/1RStranslocationinwheatcultivars

Zhang Yuwei1,2,Liu Bo2,Liu Taiguo2,Gao Li2,Chen Wanquan2

(1.YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Using SCAR or STS molecular markers, 75 Chinese commercial wheat cultivars were detected for the existence of stripe rust-resistant genesYr10 andYr18 and 1BL/1RS translocation from 2006 to 2010.The results showed that there were 13 cultivars containingYr10 gene, accounting for 17.3% of the total tested cultivars, only 1 cultivars withYr18, accounting for 1.3%, and 25 cultivars with 1BL/1RS translocation, accounting for 33.3%.Wheat cultivar ‘Xinong 928’ was found to contain bothYr10 andYr18.1BL/1RS translocation, which is resistant to most popular stripe rust races, has been widely used in wheat breeding programs.The slow rust resistance geneYr18 was seldom used in wheat breeding.Therefore, we suggest that the application ofYr18 gene be increased.

wheat; molecular marker; stripe rust resistance gene; 1BL/1RS translocation

2013-04-23

： 2013-05-18

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD19B04);國(guó)家“973”計(jì)劃(2013CB127704);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903035);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-03)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371884)

S 435.121.42

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.009

* 通信作者 E-mail:tgliu@ippcaas.cn；wqchen@ippcaas.cn