馬鈴薯炭疽病(Colletotrichumcoccodes)拮抗菌株的篩選及鑒定

王涵琦，暢 濤，楊成德，陳秀蓉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070)

馬鈴薯炭疽病(Colletotrichumcoccodes)拮抗菌株的篩選及鑒定

王涵琦，暢 濤，楊成德*，陳秀蓉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070)

采用對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)馬鈴薯炭疽病的拮抗菌株進(jìn)行了篩選和鑒定。結(jié)果表明，拮抗菌株ZHA10對(duì)炭疽病病原菌具有良好的抑制作用，抑制率達(dá)76.43%，其可以使病原菌菌絲變形和裂解；ZHA10菌體短桿狀、革蘭氏陽(yáng)性、大小為(0.5～0.75)μm × (1.5 ～3.1)μm、芽胞中至尖端生。通過(guò)生理生化測(cè)定、16S rDNA以及gyrB序列分析，鑒定ZHA10為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。此外，ZHA10還對(duì)番茄早疫病菌(Alternariasolani)、馬鈴薯干腐病菌(Fusariumoxysporum)、孜然根腐病菌(Fusariumsolani)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)和馬鈴薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)均具有較強(qiáng)的拮抗作用。ZHA10抑菌能力良好，抑菌譜寬，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用的潛力。

炭疽病； 生防菌株； 篩選； 鑒定

生物防治(biological control)是指利用有益生物及其生物代謝產(chǎn)物對(duì)植物病害進(jìn)行有效防治，從而為生產(chǎn)者、消費(fèi)者和環(huán)境降低風(fēng)險(xiǎn)，提高利益[1]。目前，用于植物病害生物防治的生防因子主要有真菌、細(xì)菌、放線(xiàn)菌和病毒等。研究報(bào)道，生防真菌木霉已用于防治花生立枯病菌、水稻紋枯病菌、水稻惡苗病菌、辣椒炭疽病菌、白術(shù)白絹病菌等多種植物病害以及蔬菜根腐病等土傳病害[2]。 生防細(xì)菌則主要有芽胞桿菌(Bacillus)[3]、假單胞桿菌(Pseudomonas)、土壤放射桿菌[Agrobacteriumradiobacter(Beijerinck and van Delden) Conn][4-5]等。以芽胞桿菌開(kāi)發(fā)的Companio、HiStickN/TKo-diak和Serenade,以假單胞菌開(kāi)發(fā)的BioJect Spot-Less、Bio-save、BlightBan和Cedomon,以放射性農(nóng)桿菌開(kāi)發(fā)的Galltrol和Nogall可控制多種植物病害[6]。馬鈴薯炭疽病由半知菌亞門(mén)炭疽菌屬的球炭疽菌引起，病菌抗逆能力強(qiáng)，存活時(shí)間較長(zhǎng)[7]。該病是近年甘肅省馬鈴薯種植區(qū)的一種主要病害，能夠侵染馬鈴薯的各個(gè)部位，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[8]。有關(guān)馬鈴薯炭疽病生物防治的方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，故本試驗(yàn)擬從高寒草地牧草內(nèi)生菌中篩選出對(duì)馬鈴薯炭疽病具有良好防效的生防細(xì)菌并鑒定，以期為馬鈴薯炭疽病的生物防治提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

指示菌：馬鈴薯炭疽病菌[Colletotrichumcoccodes(Wallr.)Hughes]、馬鈴薯干腐病菌[Fusariumoxysporum(Mart.)Sacc.]、黃瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumOwen)、孜然根腐病菌[Fusariumsolani(Mart.)Sacc.]、馬鈴薯褐腐病菌[Stysanusstemonitis(Smith) Smith]、小麥根腐病菌[Bipolarissorokiniana(Sacc.)Subram.Gain.]、番茄早疫病菌[Alternariasolani(EllisetMartin) JonesetGrout]，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

供試拮抗菌株：土壤細(xì)菌B1和B2；401、ZHA10、ZA1、TY、XA7、ZHA4、T4、ZB2、ZHC11、ZHA9、ZA14和402等從149株高寒草地牧草內(nèi)生細(xì)菌中初篩出的拮抗菌株，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院微生物多樣性實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株的篩選

將供試菌株與指示菌分別接于牛肉胨、PDA平板上活化后，用打孔器打成直徑為6 mm的菌餅。取指示菌一塊置于平板中央，在距中央3 cm的圓周上等距離接4塊供試菌株(即對(duì)峙法)，重復(fù)3次，后置于28 ℃下培養(yǎng)，對(duì)照滿(mǎn)皿后，十字法測(cè)量菌落直徑，重復(fù)3次，計(jì)算抑制率。并分別挑取處理組和對(duì)照組病原菌菌落邊緣的菌絲體，制片，在顯微鏡下觀(guān)察菌絲形態(tài)的變化并拍照。

抑制率(%)=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-原菌餅直徑)×100。

1.2.2 抑菌譜測(cè)定

采用對(duì)峙培養(yǎng)法，測(cè)定拮抗菌對(duì)幾種病原菌的抑菌能力，方法同1.2.1。

1.2.3 生防菌株的生理生化鑒定

1.2.3.1培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征

拮抗菌活化后分別接種于NA斜面、平板及NB培養(yǎng)液，于28 ℃下培養(yǎng)5 d后觀(guān)察培養(yǎng)性狀。將拮抗菌在牛肉胨平板上活化培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行革蘭氏染色和芽胞染色[9]，觀(guān)察菌體和測(cè)量菌體的長(zhǎng)度及寬度(30個(gè))，并顯微拍照。

1.2.3.2生理生化測(cè)定

具體方法參照《常見(jiàn)系統(tǒng)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]進(jìn)行。

1.2.3.316S rDNA序列分析

按上海生工提供的試劑盒(Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒)提取DNA并檢測(cè)，對(duì)具有特異性DNA條帶樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

使用引物1(5′-CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3′)和引物2(5′-CGGGATCCT ACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性10 s，54 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；最后在68 ℃下延伸7 min，終止反應(yīng)。反應(yīng)體系：10×buffer(含MgCl2)5 μL，dNTP (2.5 mmol/L)1 μL。primer 1(10 μmol/L)1 μL，primer 2 (10 μmol/L)1 μL，Taq poly-merse (2 U/μL)0.4 μL, Target DNA (10 ng/μL)1 μL，ddH2O 40.6 μL，總體積為50 μL。經(jīng)檢測(cè)，將具特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序，所測(cè)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的序列進(jìn)行相似性比較(http:∥www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，并采用Clustal(1.8)軟件進(jìn)行多重序列比較，再用Mega(4.0)軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[13]，確定拮抗菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.2.3.4gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

gyrB基因序列分析使用引物UP-1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTG-GAAAGTTCGA-3′)和引物UP-2(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCATCTACGTCAGCGTC-AGTCAT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增[21]。擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，Taq酶 1 μL，UP-1 1 μL，UP-2 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 15.5 μL，總體系25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；4 ℃保持1 h。其他方法同1.2.3.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

結(jié)果表明，菌株TY和ZA14等菌株與炭疽菌重疊生長(zhǎng)，無(wú)拮抗作用；ZHA4和402菌株與炭疽菌之間沒(méi)有明顯的界線(xiàn)，但菌落內(nèi)炭疽菌不能生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用明顯；B1、B2、T4、401、ZA1、XA7、ZHA10、ZHC11、ZB2和ZHA9菌落周?chē)忻黠@的抑菌圈，抑菌作用明顯，且抑制率均在70%以上，B1、B2和ZHA10對(duì)馬鈴薯炭疽病菌抑制率均在76%以上(表1)。ZHA10為高寒草地牧草內(nèi)生細(xì)菌，其可能具有較強(qiáng)的耐低溫性，有利于馬鈴薯窖藏期低溫時(shí)期應(yīng)用，因此本試驗(yàn)選用高寒草地內(nèi)生細(xì)菌ZHA10為研究對(duì)象進(jìn)行以下試驗(yàn)。

表1供試強(qiáng)拮抗菌株對(duì)馬鈴薯炭疽病菌的抑制效果

Table1TheinhibitionofColletotrichumcoccodesbytheantagonists

拮抗菌Antagonisticbacterium菌落直徑/cmDiameterofcolony抑制率/%InhibitionrateB22．32±0．00176．43bT42．59±0．01272．85de4012．54±0．00573．57cdeZA12．43±0．00275．00bcXA72．65±0．02472．14eB12．10±0．00279．29aZHA102．32±0．00576．43bZHC112．48±0．06074．29cdZB22．87±0．00569．29fCK8．21±0．013-

圖1 B1、B2和ZHA10對(duì)炭疽菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic reaction of the strains B1,B2 and ZHA10 against Colletotrichum coccodes

用ZHA10處理馬鈴薯炭疽菌后，炭疽菌菌絲生長(zhǎng)形態(tài)異常，出現(xiàn)膨大、扭曲現(xiàn)象，菌絲內(nèi)的原生質(zhì)發(fā)生凝集，菌絲頂端和中部出現(xiàn)泡狀物，菌絲的泡狀物破裂，原生質(zhì)外溢。對(duì)照菌絲光滑，均勻(圖2)。

2.2 抑菌譜測(cè)定

在測(cè)試的7種病原真菌中，ZHA10對(duì)馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯干腐病菌和番茄早疫病菌的抑制效果良好，抑制率分別是72.62%、72.28%和70.38%；對(duì)孜然根腐病菌、小麥根腐病菌、黃瓜枯萎病菌和馬鈴薯褐腐病菌的抑制效果次之，但也在60%以上(表2)。說(shuō)明ZHA10對(duì)馬鈴薯的多種病原菌有很好的抑制作用。其抑菌譜寬，在馬鈴薯病害生物防治中潛力大。

表2ZHA10對(duì)其他病原真菌的抑制作用

Table2AntagonisticspectrumofZHA10againstpathogens

供試病原菌Pathogenicfungus菌落直徑/cmDiameterofcolony對(duì)照/cmCK抑制率/%Inhibitionrate孜然根腐病菌Fusariumsolani2．957．4565．45小麥根腐病菌Bipolarissorokiniana3．357．7761．63黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf．sp．cucumerinum3．508．0761．16番茄早疫病菌Alternariasolani2．557．1870．38馬鈴薯干腐病菌Fusariumoxysporum2．688．1272．28馬鈴薯褐腐病菌Stysanusstemonitis2．336．2563．30馬鈴薯炭疽病菌Colletotrichumcoccodes2．316．8372．62

2.3 拮抗菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征

拮抗菌株ZHA10為革蘭氏陽(yáng)性，短桿狀(圖3左)，芽胞中至尖端生(圖3右)，菌體大小為(0.5～0.75)μm×(1.5～3.1)μm。在NA平板上，菌落扁平，大小為0.5 cm，呈不規(guī)則狀，邊緣裂片狀，顏色乳白色，邊緣乳黃色。有黏性，質(zhì)軟，菌落不透明。

圖3 ZHA10革蘭氏染色(左)和芽胞染色(右)(20×100)Fig.3 Gram staining (left) and spore staining (right) of ZHA10

2.3.2 生理生化特征

生理生化結(jié)果表明，ZHA10菌株在厭氧條件下可以生長(zhǎng)；最高生長(zhǎng)溫度為40 ℃，最低生長(zhǎng)溫度為15 ℃，最適宜生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃；可以在pH6.8和pH5.7的營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)；能夠利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸；可以使明膠液化；能水解淀粉和還原硝酸鹽；不能利用丙二酸鹽；V-P測(cè)定為陽(yáng)性；具有耐鹽性,可以在10% 的NaCl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；接觸酶、酪朊水解呈陽(yáng)性, 苯丙氨酸脫氨酶、酪胺酸水解均呈陰性。經(jīng)與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)照，上述特征均符合芽胞桿菌生理生化特征，初步鑒定ZHA10為芽胞桿菌。

2.3.3 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

菌株ZHA10的序列長(zhǎng)度為 1 451個(gè)堿基序列。經(jīng)Blast相似性分析，菌株ZHA10與多株芽胞桿菌屬菌株相似度均達(dá)到99%以上，用MEGA version 4.0將菌株ZHA10與來(lái)自 GenBank的5株不同種芽胞桿菌一起構(gòu)建基于 16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖 4)，結(jié)果顯示，ZHA10與枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)GQ861467、芽胞桿菌(Bacillussp.)EU442608聚在一起，說(shuō)明ZHA10與枯草芽胞桿菌遺傳距離更近，結(jié)合生理生化結(jié)果初步鑒定ZHA10為枯草芽胞桿菌。

圖4 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的ZHA10 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain ZHA10

2.3.4 gyrB序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

對(duì)菌株ZHA10的gyrB序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，得到的片段長(zhǎng)度為1 000個(gè)堿基序列。用BLAST軟件經(jīng)相似性比較，結(jié)果表明ZHA10與已報(bào)道的Bacillussubtilis(JX282194)和Bacillussubtilis(JQ653052)等菌株的相似性在99%以上。用Mega(4.0)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，ZHA10與Bacillussubtilis(JX282194)最近(圖5)。菌株ZHA10的形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征與枯草芽胞桿菌一致，結(jié)合基于 16S rDNA 序列和gyrB序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果，將菌株ZHA10鑒定為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。

圖5 ZHA10的gyrB系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of ZHA10 gyrB

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯的種植面積日益擴(kuò)大，其病害的發(fā)生也日益嚴(yán)重，尤其是馬鈴薯儲(chǔ)藏期的病害。對(duì)儲(chǔ)藏期的病害不宜進(jìn)行化學(xué)防治，而生物防治具有定殖能力強(qiáng)，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，適合防治儲(chǔ)藏期馬鈴薯炭疽病的發(fā)生，這與趙妍，穆常青[14-15]研究表明枯草芽胞桿菌能夠有效控制采后水果的多種疫病一致。目前研究也已經(jīng)證明了枯草芽胞桿菌是一種理想的生防細(xì)菌[16-18]。

由于細(xì)菌16S rDNA具有高度保守性，對(duì)相似率極高的近緣種無(wú)法做進(jìn)一步區(qū)分[19]，其平均堿基替換率為每5 000萬(wàn)年變化1%，比gyrB基因的堿基替換率每100萬(wàn)年變化0.7%～0.8%要慢[20]，在比較一些相似性比較高的近緣種時(shí)，gyrB基因更能準(zhǔn)確地鑒定到種。因此，本試驗(yàn)通過(guò)16S rDNA、gyrB基因序列相似性分析、菌體形態(tài)觀(guān)察及生理生化測(cè)定結(jié)果，將ZHA10鑒定為枯草芽胞桿菌(B.subtilis)，而這種鑒定細(xì)菌的方法也是一種快速鑒定的方法。

本試驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室保存的土壤細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌中篩選并獲得了對(duì)馬鈴薯炭疽病具有高效拮抗作用的菌株ZHA10，在平板對(duì)峙試驗(yàn)中其抑制率達(dá)72.62%，抑菌機(jī)制主要是使病原菌菌絲變形、裂解。同時(shí)對(duì)早疫病菌、褐腐病菌、干腐病菌等馬鈴薯病原菌具有良好的抑制作用。所以，ZHA10在馬鈴薯病害的生物防治方面具有較好的利用價(jià)值，且該拮抗菌分離自高寒草地牧草體內(nèi)，具有良好的抗(耐)低溫特性，在防治馬鈴薯貯藏期病害中也具有優(yōu)勢(shì)。該拮抗菌雖然在室內(nèi)抑菌能力較強(qiáng)，但是，其在大田防治效果、發(fā)酵工藝以及在植物體內(nèi)定殖情況等方面還需進(jìn)一步研究。

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ScreeningandidentificationoftheantagonisticorganismsagainstColletotrichumcoccodesonpotato

Wang Hanqi，Chang Tao，Yang Chengde，Chen Xiurong

(CollegeofGrassland,GansuAgriculturalUniversity；KeyLaboratoryofGrasslandEcosystemUniversity,MinistryofEducation；PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince；Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

In this study, the biocontrol strain ofColletotrichumcoccodeson potato was screened by confrontation culture method.The results showed that the strain ZHA10 had good inhibition againstC.coccodes, and the inhibition rate reached 76.43%.In order to understand the bacteriostatic mechanism of the endophytic strain ZHA10 toC.coccodesand its taxonomic status, a series of physiological and biochemical experiments were conducted.The results showed that the antibacterial activity was mainly due to hyphal deformation and cracking.ZHA10 was short rod-shaped, gram-positive, and (0.5-0.75) μm×(1.5-3.1)μm in size, with endospores growing from the center to the tip.Through 16S rDNA andgyrBgene sequence analysis, ZHA10 was identified asBacillussubtilis.Besides, ZHA10 could effectively inhibit the growth ofAlternariasolani,Fusariumoxysporum,Fusariumsolani,Bipolarissorokiniana,FusariumoxysporumandStysanusstemonitis, which showed that ZHA10, with broad spectrum and high antagonistic activity against pathogenic fungi, had good potential for development and application.

Colletotrichumcoccodes; biocontrol strain; screening; identification

2013-05-24

： 2013-08-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160122)

S 435.32

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.006

* 通信作者 E-mail:yangcd@gsau.edu.cn