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    虻蟲活性蛋白聚糖結(jié)構(gòu)中單糖、氨基酸組成及分子量的分析測(cè)定

    2014-08-09 08:45:46劉大有蔡廣知王淑敏陳迎男鄧明魯
    吉林中醫(yī)藥 2014年10期
    關(guān)鍵詞:蛋白聚糖乙?;?/a>分子量

    劉大有,趙 博,蔡廣知,王淑敏,陳迎男,徐 莉,鄧明魯

    (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)春 130117)

    中藥虻蟲為虻科昆蟲腹帶虻(TabanusbivittanusMat.)等的雌性蟲體[1],是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。虻蟲在我國(guó)大部分地區(qū)都有分布,以牧區(qū)居多,資源豐富,但野生采收較為困難,因此研究不多。對(duì)虻蟲的藥用成分和性質(zhì)了解也較少。虻蟲具有逐瘀、破積、通經(jīng)的功效,用于治療癥瘕、少腹蓄血、血滯經(jīng)閉、撲損瘀血等癥,是大黃 蟲丸等中藥成方的主藥之一[1-2]。前人曾對(duì)中藥虻蟲有過化學(xué)及藥理作用研究。楊星勇等[3]從華廣虻(TabanusameanusWalke)中分離純化出纖溶活性蛋白TAFP,及TFC1和TFC2[4]。劉大有[5]對(duì)姚虻(TabanusyaoMacquart)中多糖類成分進(jìn)行了提取和分離,從制備性高效液相分離得到高純度多糖TybⅡ。金偉[6]從爾瘤虻(TabanusnodiferaWang)中分離得到糖胺聚糖TAG。等離子體發(fā)射光譜法對(duì)虻蟲中的微量元素進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其中含有豐富的微量元素如Fe、Zn、Cr、Mn、Mg、Sr等[7]。芮和愷等[8]采用氣相層析從腹帶虻中分離得到棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸4種有機(jī)酸類化合物。藥理活性研究表明,虻蟲提取物具有延長(zhǎng)動(dòng)物凝血時(shí)間,降低血漿中纖維蛋白原的含量[9]、改善血液流變參數(shù)(減少血漿中纖維蛋白原含量,抑制血小板黏附性,降低全血黏度比、血漿黏度比和降球壓積,減慢血沉速度)[10]、抑制體內(nèi)血栓生成[11]等作用。臨床應(yīng)用其治療血液系統(tǒng)疾病[12-13],肝病[14-15],婦科疾病[16-17]及皮膚科疾病等[18]。 本課題在前人研究的基礎(chǔ)上,首次對(duì)虻蟲中寶雞虻(TabanusbaojiensisXu)提取的蛋白聚糖結(jié)構(gòu)中單糖、氨基酸組成及分子量范圍進(jìn)行了研究。為中藥虻蟲蛋白聚糖的應(yīng)用開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

    實(shí)驗(yàn)用虻蟲藥材經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院飲片加工廠購(gòu)自安徽亳州,產(chǎn)地為四川,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲教研室史樹森教授鑒定為寶雞虻(TabanusbaojiensisXu),屬姚虻群。Sartorious BS110S電子天平(德國(guó)sartorious公司生產(chǎn));DGE 30/14-IIA電熱鼓風(fēng)干燥箱(南京化學(xué)儀器廠生產(chǎn));UNICAM紫外分光光度計(jì)(美國(guó)熱電儀器集團(tuán)公司生產(chǎn));RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn));LGJ-10冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠生產(chǎn));HYDRASYS自動(dòng)電泳儀(法國(guó)Sebia公司生產(chǎn));Varian3400GC氣相色譜儀(美國(guó)VARIAN公司生產(chǎn));Agilent1100液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn));Agilent GC-MS 689015973N氣質(zhì)聯(lián)用分析儀(美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn))。氯化鈉、三氯乙酸、過氧化氫、醋酸鉛、醋酸氨、濃硫酸、碘化鉀、酸性氯化亞錫、碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸 鹽酸、葡萄糖(TLC用)、鼠李糖、阿拉伯糖等,均為北京化工廠生產(chǎn)的分析純?cè)噭?,所用乙?醇沉淀用)為醫(yī)用乙醇。胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄糖對(duì)照品(GC用)均為美國(guó)sigma公司生產(chǎn)??捡R斯亮蘭R.250、電泳凝膠、免磷酸化酶、牛血清蛋白、兔肌動(dòng)蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制劑、雞蛋清溶菌酶均為瑞典Amersham公司產(chǎn)品。SephadexG-200為瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品。標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白為德國(guó)BOEHRINGER MANHEIMGmbh公司產(chǎn)品?;钚蕴繛樵噭┘?jí),四川省峨邊華泰活性炭有限責(zé)任公司生產(chǎn)。薄層硅膠預(yù)制板為青島海洋化工廠生產(chǎn)。透析袋為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)(進(jìn)口分裝)。

    2 虻蟲蛋白聚糖制備

    虻蟲藥材破碎,以10倍量生理鹽水60 ℃浸漬3次,每次12 h,濾過,濾液60 ℃減壓濃縮至1 g原藥材/mL,加CCl3COOH至終濃度5%,4 ℃靜止24 h,抽濾,濾液加水稀釋至0.2 g原藥材/mL,加H2O2至濃度達(dá)2%,靜止8 h脫色,NaOH調(diào)PH中性,3500分子量截流透析袋常水透析48 h,蒸餾水透析24 h,60 ℃減壓濃縮至0.5 g原藥材/mL,加乙醇至含醇量70%,4 ℃靜止過夜,上清液加乙醇至含醇量90%,4 ℃靜止過夜,過濾收集沉淀部分,60 ℃揮干殘留乙醇,加水稀釋至0.5 g原藥材/mL,-49 ℃冷凍干燥48 h即得。

    3 虻蟲蛋白聚糖水解液?jiǎn)翁墙M成測(cè)定

    3.1 TLC檢識(shí)

    3.1.1 虻蟲蛋白聚糖的水解 樣品30 mg以50 mL 1 mol/L硫酸封管120 ℃水解1 h,加Ba(OH)2調(diào)PH至7,離心,上清液100 ℃水浴揮干。

    3.1.2 虻蟲蛋白聚糖水解液薄層檢識(shí) 將水解液揮干所得粉末及單糖對(duì)照品分別用蒸餾水溶解,水溶液依次點(diǎn)于硅膠薄層板后,進(jìn)行展開、顯色。

    展開劑:正丙醇∶氨水∶水(60∶40∶5); 顯色劑:硫酸∶乙醇∶苯酚(0.5 mL∶9.5 mL∶0.3g); 顯色條件:105 ℃加熱10 min。

    結(jié)果:TLC顯示蛋白聚糖水解液中單糖組成為葡萄糖。

    3.2 GC檢識(shí)

    3.2.1 乙酰化物的制備(糖腈乙?;?[19]稱取2所得干燥粉末及葡萄糖對(duì)照品各10 mg,分別加入鹽酸羥胺8 mg,吡啶0.5 mL,于90 ℃水浴并振蕩,30 min后取出,冷卻至室溫后,加入醋酸酐0.5 mL,90 ℃繼續(xù)加熱30 min乙?;玫揭阴;铩R阴;餃p壓蒸干,加氯仿2 mL溶解,即得供試液。

    3.2.2 乙?;颰LC檢識(shí) 將2所得對(duì)照品、樣品及空白乙?;锫确氯芤?與葡萄糖對(duì)照品、樣品水溶液依次點(diǎn)于硅膠薄層板后,進(jìn)行展開、顯色。(TLC展開劑、顯色劑及顯色條件同2)。

    結(jié)果:TLC肉眼觀察原單糖位置無斑點(diǎn)顯色,乙酰化較為完全。

    3.2.3 乙?;颎C檢識(shí)

    3.2.3.1 氣相色譜條件 氣相色譜柱:SE-54 15 mm×0.22 mm×0.25 μm;氣相柱升溫程序:150 ℃(2 min)→10 ℃/ min 250 ℃→(20 min);進(jìn)樣口溫度:300 ℃;柱壓:90 kpa;檢測(cè)器:FID(300 ℃)。

    3.2.3.2 氣相色譜檢識(shí) 用微量進(jìn)樣器精密吸取0.2 μL 2項(xiàng)所得供試液及對(duì)照品乙?;锫确氯芤鹤⑷霘庀嗌V儀進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1、圖2。

    結(jié)論:TLC上虻蟲蛋白聚糖水解液與葡萄糖對(duì)照品溶液斑點(diǎn)位置一致,GC出峰時(shí)間一致,表明虻蟲蛋白聚糖的單糖組成為葡萄糖。

    4 虻蟲蛋白聚糖氨基酸組成測(cè)定(HPLC法)

    4.1 測(cè)定方法 照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005版一部,附錄VID)測(cè)定。由于熒光監(jiān)測(cè)器FID對(duì)胱氨酸、賴氨酸不敏感,采用二級(jí)管陣列DAD、FID雙檢測(cè)器。

    圖1 葡萄糖對(duì)照品乙?;颎C

    圖2 蛋白聚糖水解液干燥產(chǎn)物乙酰化物GC

    4.2 HPLC色譜條件 儀器型號(hào):Agilent 1100;色譜柱:Iorbax EClipse AAA.4.6 mm×75 mm×3.5 μm;流動(dòng)相:A:PH值7.8 NaH2PO4緩沖液,B:乙腈:甲醇:水(45∶45∶10);檢測(cè)器:DAD二級(jí)管陣列、FID熒光;流速:2 mL/min。對(duì)照品溶液制備:17種Sigma-aldrich氨基酸對(duì)照品配制成2.5 μg/mL蒸餾水溶液。

    4.3 樣品水解液制備 稱取虻蟲蛋白聚糖樣品30 mg,置水解管中,加入10 mL 6 mol/L HCl、0.1%巰基乙醇充氮?dú)夂蠓馍w,110 ℃水解24 h。

    4.4 水解液氨基酸組成測(cè)定 用微量進(jìn)樣器精密移取各對(duì)照品溶液及虻蟲蛋白聚糖水解液0.2 μL,注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3、圖4(上圖為DAD二級(jí)管陣列檢測(cè)器檢測(cè)結(jié)果,下圖為FID檢測(cè)器檢測(cè)結(jié)果,nva為儀器校正內(nèi)標(biāo))。

    對(duì)比虻蟲蛋白聚糖水解液與對(duì)照品出峰時(shí)間,確定水解液中所含氨基酸種類,通過峰面積計(jì)算水解液中各種氨基酸所占百分比,結(jié)果見表1。

    結(jié)果:虻蟲蛋白聚糖水解液中共檢測(cè)出天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸等16種氨基酸,未發(fā)現(xiàn)胱氨酸。

    圖3 氨基酸對(duì)照品HPLC

    圖4 樣品水解液HPLC

    檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果/(g/100 g)檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果/(g/100 g)天冬氨酸2.23胱氨酸 —谷氨酸 3.19纈氨酸 0.55絲氨酸 0.99蛋氨酸 0.18組氨酸 0.56苯丙氨酸0.34甘氨酸 1.42異亮氨酸0.39蘇氨酸 0.83亮氨酸 0.55精氨酸 1.17賴氨酸 1.22丙氨酸 1.18脯氨酸 0.64酪氨酸 0.47總 和 15.89

    5 虻蟲蛋白聚糖分子量范圍測(cè)定

    5.1 電泳測(cè)定

    5.1.1 電泳條件 SOD.PAGE分析:Laemmi法,不連續(xù)膠系統(tǒng),5%濃縮膠,15%分離膠,考馬斯亮蘭R.250顯色,marker為Amersham公司出品。

    5.1.2 虻蟲蛋白聚糖分子量測(cè)定 分別將待測(cè)樣及對(duì)照品以蒸餾水配制成各1 mg/mL的溶液,于凝膠上進(jìn)行電泳,結(jié)果見圖5。

    結(jié)果:電泳結(jié)果顯示虻蟲蛋白聚糖分子量范圍約為8 000~35 000。

    5.2 sephadex G-200凝膠柱測(cè)定

    5.2.1 sephadex柱層析條件 sephadexG-200為Pharmacia公司產(chǎn)品,蒸餾水浸泡24 h充分溶脹后裝柱,凝膠柱1.5 cm×97 cm,蒸餾水洗脫,流速1 mL/min。

    5.2.2 藥液配制 不同分子量對(duì)照品及虻蟲蛋白聚糖樣品以蒸餾水配制成1 mg/mL的溶液后上柱。

    5.2.3 測(cè)定方法 不同分子量對(duì)照品依次上柱,自流下第一滴洗脫液開始計(jì)算洗脫體積,每管3 mL收集洗脫液,直至酚-硫酸顯色反應(yīng)呈陽性為止,記錄各自從凝膠柱上洗脫的體積。蘭葡聚糖凝膠(分子量2,000,000)上柱測(cè)得其洗脫體積Vo=71.5 mL,此即水體積。不同分子量對(duì)照品上柱測(cè)定洗脫體積Ve。結(jié)果見表2。

    結(jié)果:計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y=-0.805X+5.560 5(r=0.992 5),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖6所示。

    圖6 對(duì)照品凝膠柱洗脫標(biāo)準(zhǔn)曲線

    虻蟲蛋白聚糖水溶液上柱洗脫,洗脫液不經(jīng)顯色于280 nm處得吸光度A2(圖14中系列2),洗脫液按酚-硫酸法顯色,于490 nm處測(cè)得吸光度A1,結(jié)果見表3。

    表3 sephadex凝膠柱洗脫體積與吸光度

    按表3繪制樣品洗脫圖如圖7。

    圖7 樣品洗脫圖

    結(jié)果:多糖類物質(zhì)洗脫體積為135~168 mL,蛋白類物質(zhì)洗脫體積為138~165 mL。 結(jié)論:洗脫體積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算求得虻蟲蛋白聚糖分子量范圍為(1.03~3.92)×104。多糖類物質(zhì)洗脫體積與蛋白類物質(zhì)洗脫體積基本一致,證明所得提取物為蛋白與大分子糖類結(jié)合而成的蛋白聚糖。

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