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    應(yīng)用微衛(wèi)星PCR技術(shù)鑒別中國林蛙

    2014-08-09 08:45:44蔡廣知張彥飛貢濟宇
    吉林中醫(yī)藥 2014年10期
    關(guān)鍵詞:林蛙伊春微衛(wèi)星

    蔡廣知,鄭 丹,張彥飛,貢濟宇

    (長春中醫(yī)藥大學(xué),長春 130117)

    微衛(wèi)星DNA指紋圖譜(microsatellite,MS)又稱為短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats,STR)或簡單序列重復(fù)(simple sequnce repeat,SSR),是基因組中一段由幾十個核苷酸組成的序列,此序列一般由幾個核苷酸(一般為2~4個)為單位多次串聯(lián)重復(fù)組成[1-2]。其中以雙核苷酸重復(fù)最為常見,真核生物的基因組中有大量的微衛(wèi)星DNA存在,約每隔10~550 kb就存在一個微衛(wèi)星。微衛(wèi)星DNA由于具有特異性的PCR擴增、多態(tài)信息容量高、引物通用性好、突變率高、共顯性等特點[3-4]。本文采用微衛(wèi)星鑒別技術(shù),對長白山、黑龍江伊春、遼寧撫順、吉林四海林場4個地區(qū)的林蛙開展了鑒別研究。

    1 材料

    1.1 儀器 1110型PCR儀(美國Bio-Rad公司);TGL型臺式高速離心機(湖南星科科學(xué)儀器有限公司);Dolphin-Doc凝膠成像分析儀(美國wealtec公司);JY-SP10水平電泳槽(杭州匯爾儀器公司);電泳儀(美國Bio-Rad公司);微型離心機(北京六一儀器有限公司);PCF型超純水機(成都品成科技有限公司)。

    1.2 試劑及耗材 DL500 Marker購自寶生物工程有限公司;熒光染料(EB)和單染料購于天根生化科技有限公司;50XTAE緩沖液和瓊脂糖均購自上海生工生物工程有限公司;PCR mix(英杰生命科技有限公司);DNA提取試劑盒編號SK-8222和動物組織快速直接PCR試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司。

    2 方法

    2.1 PCR的反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系為25 μL:PCR反應(yīng)液為12.5 μL(1 x),模板為0.5 μL(0.1~10 ng),引物為上下游引物各1 μL(0.4 μmol/L),超純水10 μL,PCR反應(yīng)程序以正品長白山野生林蛙為模板。

    2.2 PCR反應(yīng)程序 95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性50 s;46~60 ℃退火50 s;72 ℃延伸90 s;共35個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min;8 ℃保存。

    2.3 特異性鑒別引物的篩選 根據(jù)GenBank發(fā)表的中國林蛙的基因序列,以及國內(nèi)外文獻的報道,選出11對微衛(wèi)星引物作為本實驗的引物,最終有5對能夠穩(wěn)定擴增:

    引物1:RCMS035 F:AATGGCGAGGAGGTTGACTA

    EU377559 R:GCAGTGTTTTATCGCTCGGT

    引物2:RCMS042 F:TCTAGCCAGCAGGTAAAACTC

    EU377560 R:GAAGTTTGTTCTATTGACCTCTGT

    引物3:RCMS092 F:CAAAAGCAGATGGCTGGATAC

    EU377562 R:GCTCTATGATAGTGCGTGAAGG

    引物4:RCMS029 F:CTATGGACAGAGCAGAAAGAC5

    EU377556 R:GCATCTGCTGGTTGGGTAGTG

    引物5:RCMS030 F:ACAGGGCAGGACATCTCAGC

    EU377557 R:GCATGGGACAAGATACTGGC

    3 結(jié)果

    3.1 5引物對不同地區(qū)林蛙的PCR電泳圖譜分析

    3.1.1 引物1的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板,加入引物1,退火溫度為52.8 ℃,模板濃度為0.5 μL,循環(huán)次數(shù)為35個循環(huán),擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳,電泳電壓為120 V,電泳時間為35 min,上樣量為0.5 μL,在全自動凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察和分析。由擴增后的電泳圖可以看出,長白山林蛙在240 bp左右有明顯的擴增條帶,黑龍江伊春的林蛙在200 bp處有明顯的擴增條帶,遼寧撫順林蛙在179 bp處有明顯的擴增條帶,吉林四海林場林蛙在220 bp處有明顯的擴增條帶。

    3.1.2 引物2的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板,加入引物2,退火溫度為55 ℃,后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明,長白山林蛙在120 bp左右有明顯的擴增條帶,黑龍江伊春的林蛙在165 bp處有明顯的擴增條帶,遼寧撫順林蛙在135 bp處有明顯的擴增條帶,吉林四海林場林蛙在150 bp處有明顯的擴增條帶。

    3.1.3 引物3的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板,加入引物3進行擴增,其退火溫度為57 ℃,后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明,長白山林蛙在200 bp左右有明顯的擴增條帶,黑龍江伊春的林蛙在150 bp處有明顯的擴增條帶,遼寧撫順林蛙在190 bp處有明顯的擴增條帶,吉林四海林場林蛙在230 bp處有明顯的擴增條帶。

    3.1.4 引物4的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板,加入引物4進行擴增,其退火溫度為57 ℃,后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明,長白山林蛙在280 bp左右有明顯的擴增條帶,黑龍江伊春的林蛙在180 bp處有明顯的擴增條帶,遼寧撫順林蛙在210 bp處有明顯的擴增條帶,吉林四海林場林蛙在245 bp處有明顯的擴增條帶。

    3.1.5 引物5的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板,加入引物5進行擴增,其退火溫度為55 ℃,后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明,長白山林蛙在280 bp左右有明顯的擴增條帶,黑龍江伊春的林蛙在180 bp處有明顯的擴增條帶,遼寧撫順林蛙在200 bp處有明顯的擴增條帶,吉林四海林場林蛙在300 bp處有明顯的擴增條帶。

    3.2 微衛(wèi)星等位基因分型 對上述5對引物的正向引物5’端用熒光標記進行修飾,分別進行40只林蛙樣本的動物DNA提取,根據(jù)上述PCR條件進行等位基因擴增。PCR產(chǎn)物應(yīng)用ABI 3730自動測序儀分型進行等位基因測試;并用GeneMapper ID v3.2軟件對等位基因進行判讀。對每對引物擴增產(chǎn)物的等位基因做頻數(shù)分布圖。結(jié)果見圖1~5。

    圖1 引物1的基因頻數(shù)分布圖

    圖2 引物2的基因頻數(shù)分布圖

    圖3 引物3的基因頻數(shù)分布圖

    圖4 引物4的基因頻數(shù)分布圖

    圖5 引物5的基因頻數(shù)分布圖

    由等位基因圖可看出,等位基因的擴增結(jié)果與瓊脂糖電泳的電泳結(jié)果無明顯差異,其片段大小均上下浮動在16bp 左右,表明這種方法準確可靠。中國林蛙長白山亞種與其它地區(qū)林蛙的等位基因片段大小頻次分布不一樣,基因片段大小差異比較大,有利于中國林蛙長白山亞種與其他種屬林蛙的區(qū)分。

    4 討論

    采用5種微衛(wèi)星引物對中國林蛙長白山亞種、黑龍江伊春林蛙、遼寧桓仁林蛙以及吉林四海林場林蛙進行PCR擴增和分析。由5對引物的PCR擴增結(jié)果可知,在瓊脂糖電泳圖中,每種引物均可以鑒別4種不同產(chǎn)區(qū)的林蛙。為使實驗結(jié)果更準確,采用熒光標記的方法進行等位基因擴增,進一步驗證了微衛(wèi)星鑒別方法的準確性和可靠性。

    微衛(wèi)星PCR結(jié)果雖有差異,但5種引物的擴增片段大小差異并不大,實際應(yīng)用中可采用多種引物分別進行鑒別,綜合多引物擴增片段的結(jié)果來評價和鑒別。每個物種的不同引物PCR擴增片段的大小均不相同,增加引物進行研究可以提高鑒別的精準度,今后可考慮大量篩選微衛(wèi)星引物,增加選取樣品的品種和數(shù)量,篩選具有更高特異性的微衛(wèi)星引物[5-7]。

    [1]Yang W,Qi Y,Bi K,et al.Toward understanding the genetic basis of adaptation to high-elevation life in poikilothermic species:a comparative transcriptomic analysis of two ranid frogs,Rana chensinensis and R.kukunoris[J].BMC Genomics,2012(1):583-588.

    [2]Zhao J,Sun Y,Li Z,et al.Molecular cloning of novel antimicrobial peptide genes from the skin of the Chinese brown frog,Rana chensinensis[J].Zoolog Sci,2011,28(2):112-117.

    [3]Zhang H,Wu Q.Studies on the multiple gene system and gene linkage of lactate dehydrogenase in Rana chensinensis[J].Yi Chuan Xue Bao,1996,23(1):11-17.

    [4]Fushimi H,Komatsu K,Isobe M,et al.A new approach for the identification of a Chinese traditional medicine “Chuan xiong” by 18S ribosomal RNA sequences[J].Phytomedicine,1997,3(4):387-389.

    [5]詹立平,趙鑫,劉志梅.基于PCR技術(shù)的現(xiàn)代分子生物學(xué)操作在中藥鑒定中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥商報,2013,10(7):12-15.

    [6]李力,徐永莉,張月云,等.DNA分子標記在中藥鑒定中的應(yīng)用及發(fā)展趨勢分析[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(11):23.

    [7]王樂,李素霞,陳晶.中藥指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].河北化工,2010,33(1):34-36.

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