鹿角膠在大鼠離體腸的吸收研究

律廣富,李 娜,林 ,曲曉波,楊 擎,王建瑋,林 賀

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

鹿角膠的主要成分為蛋白質(zhì)，鹿角膠始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名為“白膠”，列為上品[1]。鹿角膠的應(yīng)用有2000多年的歷史，中醫(yī)用之補(bǔ)益氣血、滋腎生精；主治腎氣不足、陽(yáng)痿羸瘦、精血虛虧、神倦目昏、腰膝無(wú)力、婦女血閉不妊、子宮虛冷、崩漏帶下等癥[2]?？诜侵兴幖捌渲苿┳畛Ｒ?jiàn)的臨床給藥途徑之一，而吸收是口服制劑發(fā)揮療效的關(guān)鍵[3]。藥物吸收涉及藥物通過(guò)胃腸道上皮細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液循環(huán)，是決定口服藥物生物利用度的重要因素。影響藥物吸收的原因很多：藥物的溶解性，滲透性，化學(xué)結(jié)構(gòu)及胃腸道生理因素等[4]，小腸是口服制劑的主要吸收部位，藥物腸吸收在某一程度上能反映藥物口服后整體的吸收情況[5]。本實(shí)驗(yàn)采用氨基酸分析儀檢測(cè)在不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)離體腸吸收后18種氨基酸的含量，探討鹿角膠在離體腸內(nèi)的吸收情況，為進(jìn)一步研究鹿角膠在體內(nèi)吸收分布提供依據(jù)。鹿角膠中主要成分為蛋白質(zhì),其含量在50%以上，中國(guó)藥典2010年版一部“鹿角膠”項(xiàng)下含量測(cè)定方法為定氮法，該方法只能測(cè)定樣品中總的含氮量，不能準(zhǔn)確地反映樣品中各種有效成分的真實(shí)情況[6]。本實(shí)驗(yàn)采用氨基酸分析儀檢測(cè)18種常見(jiàn)氨基酸的含量，考察經(jīng)鹿角膠在腸道內(nèi)的吸收情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品 鹿角膠由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 17種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自Sigm公司;L-羥脯氨酸(美國(guó)Sigma公司，純度≥99.0%)；苯酚(重蒸)；0.1 mol/L鹽酸；實(shí)驗(yàn)用水為18.2 MΩ。

1.3 儀器 日立835-50氨基酸分析儀，HW-2000氨基酸分析專(zhuān)用色譜工作站等；SJ-4型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠(chǎng))；透皮吸收儀(山東泰盟儀器有限公司)；eppendorf-80 ℃冰箱。

1.4 動(dòng)物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，清潔級(jí)，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXX-(吉)2010-0005。

2 方法

2.1 氨基酸對(duì)照品貯備液的制備 精密稱(chēng)取17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品及L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各20 μL至5 mL容量瓶，分別用0.1 mol/L的HCl定容至5 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液。置于-4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 離體腸的制備 取SD大鼠，10%水合氯醛麻醉，打開(kāi)腹腔，小心分離出小腸，剪斷(長(zhǎng)度約2 cm)，縱向剖開(kāi)，生理鹽水沖洗干凈，備用。

2.3 腸離體吸收實(shí)驗(yàn) 取離體鼠腸，生理鹽水沖洗，將其固定于接收池與擴(kuò)散池中間，使內(nèi)層面向供給池，供給池中加入鹿角膠樣品(8 mg/mL)釋放液，接受池精密加入10 mL生理鹽水，排除氣泡。有效擴(kuò)散面積為1.76 cm2。池內(nèi)循環(huán)水溫度為37.5 ℃，恒速磁力攪拌100 r/min。加樣前將鼠腸內(nèi)層表面與接收液接觸，更換全部接收液，再給藥以便降低干擾。加樣平衡30 min開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別于1、2、4、6 h取樣，每次取樣1mL，同時(shí)補(bǔ)充1 mL預(yù)溫37 ℃生理鹽水。

2.4 樣品處理[7]稱(chēng)取經(jīng)腸吸收后的樣品1 mL于蛋白水解管中，加6 mol/L鹽酸適量，滴入幾滴苯酚，充氮后封管，置于110 ℃烘箱中保持24 h，冷卻后經(jīng)濾紙過(guò)濾到20 mL容量瓶中，用超純水反復(fù)沖洗水解管及濾紙,最后定容至刻度。取1 mL的樣液于蒸發(fā)皿中在蒸氣浴上蒸干，加超純水重復(fù)3次，殘留物用0.02 mol/L HCl定容至10 mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用上機(jī)。

3 結(jié)果

3.1 采用氨基酸分析儀檢測(cè)鹿角膠腸吸收后樣品中氨基酸含量,結(jié)果見(jiàn)表1,圖1～6。

Q為T(mén)時(shí)間的累積滲透量(μg/cm2)，Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)的濃度(μg/μL)，A為滲透面積(本實(shí)驗(yàn)中儀器釋放面積為1.76 cm2),V為接受液的總體積(10 mL)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 鹿角膠腸吸收后樣品中氨基酸含量

圖1 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 給藥前原液中氨基酸含量

圖3 腸吸收1 h后含量

圖4 腸吸收2 h后含量

圖5 腸吸收4 h后含量

圖6 腸吸收6 h后含量

氨基酸1 h(ng/20 μL)2 h(ng/20 μL)4 h(ng/20 μL)6 h(ng/20 μL)天冬氨酸(Asp) 185.730237.510261.145270.818蘇氨酸(Thr) 104.545125.575224.545294.537絲氨酸(Ser) 151.300172.235180.355236.115谷氨酸(Glu) 357.740440.180453.436511.205甘氨酸(Gly) 727.955914.950993.4051 132.765丙氨酸(Ala) 321.615401.325433.624485.555半胱氨酸(Cys) 136.075144.115145.612208.442纈氨酸(Val) 173.100177.595193.395226.465蛋氨酸(Met) 60.97561.39563.89663.325異亮氨酸(Ile) 54.33564.45186.23594.545亮氨酸(Leu) 146.920169.882178.635189.225酪氨酸(Tyr) 13.93513.98515.36119.945苯丙氨酸(Phe) 675.850574.297936.445996.766賴(lài)氨酸(Lys) 236.600260.720274.122300.675組氨酸(His) 53.48061.37569.06877.541精氨酸(Arg) 270.820344.165398.885434.385脯氨酸(Pro) 817.4151 046.9751077.1051161.328L-羥脯氨酸(Hyd) 46.52056.33593.895101.337總滲透量 4 534.9105 267.0556 079.1216 804.952

3.3 鹿角膠腸吸收速率常數(shù) 以總氨基酸的累積滲透量(Q)對(duì)時(shí)間T進(jìn)行線(xiàn)性回歸，所得斜率即為鹿角膠的腸吸收的速率常數(shù)J(ng/cm2·h)。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 鹿角膠腸吸收速率常數(shù)

由圖7可知鹿角膠腸吸收的累積滲透回歸方程為：y=762.2x+3 766；其吸收速率常數(shù)為：762.2 ng/cm2·h。

4 討論

鹿角膠是用雄鹿已經(jīng)骨化的鹿角經(jīng)過(guò)水煮熬，去除渣質(zhì)后濃縮制成固體膠。該品顏色呈現(xiàn)出黃棕或紅棕色，膠質(zhì)半透明，上部分帶有黃白色泡沫層。質(zhì)地硬而脆，容易破碎，劈開(kāi)斷面光潔，透過(guò)光照發(fā)現(xiàn)不混濁[8]。氣無(wú)，味微甜。鹿角膠入藥已經(jīng)有2000多年的歷史，最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。鹿角膠的作用具有滋肝補(bǔ)腎，增精止血的功效，治療青年人的虛勞羸弱，中老年人的腰膝酸痛，男子夜夢(mèng)遺精，女子崩漏帶下等都有功效，用藥范圍針對(duì)各種人群極其廣泛[9]。近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn),鹿角膠有增加白細(xì)胞，治療大腦水腫的作用，特別是用于治療癌癥患者化療后的后遺癥療效更好。現(xiàn)研究可入丸、散、膏劑[10]。鹿角膠作用廣泛，可作為藥材與其他類(lèi)藥配伍應(yīng)用，也可作為補(bǔ)益之品延年益壽，關(guān)于鹿角膠的研究已成為現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用氨基酸分析儀定時(shí)測(cè)定鹿角膠經(jīng)腸吸收后接受液中各種氨基酸的含量，并計(jì)算其總氨基酸的累積滲透量、擴(kuò)散速率等參數(shù)，結(jié)果顯示,鹿角膠經(jīng)腸吸收后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的接收液中18種常見(jiàn)氨基酸全部檢出，且6 h的總氨基酸的吸收率達(dá)到5.3%。其吸收速率為762.2 ng/cm2·h。結(jié)果表明，鹿角膠在離體腸內(nèi)有很好的透過(guò)性能，在體內(nèi)能夠迅速的被吸收利用。

鹿角膠不僅是名貴的中藥材，而且還是補(bǔ)益佳品，其作用廣泛，可與其他藥材配伍使用，也可單味入藥。本文在鹿角膠藥理藥效研究的基礎(chǔ)上，對(duì)鹿角膠的吸收情況做一探討，結(jié)果表明，鹿角膠在離體腸內(nèi)有很好的透過(guò)性能，在體內(nèi)能夠迅速的被吸收利用。為合理的利用和開(kāi)發(fā)鹿產(chǎn)品提供參考。

[1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華本草[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,655.

[2]溫源凱.熬鹿角膠方法的改進(jìn)探討[J].中成藥研究,1979(1):34.

[3]Dokoumetzidis A,Kalantzi L,Fotaki N.Predictive models for oral drug absorption:from in silico methods to integrated dynamical models[J].Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology,2007,3(4):491-505.

[4]梁桂賢,劉謙民.藥物腸吸收研究方法近況[J].國(guó)外醫(yī)藥(合成藥·生化藥·制劑分冊(cè)),1998,19(4):251-252,247.

[5]譚曉斌,賈曉斌,陳彥,等.在體腸灌流模型及其在中藥研究中的應(yīng)用[J].中成藥,2007,29(11):1665-1668.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2009:225.

[7]陳雄偉,王桂芬.用835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)羥脯氨酸的測(cè)定方法[J].氨基酸雜志,1985(4):5-7.

[8]蒙海燕.鹿茸及鹿角膠主要傳統(tǒng)功效作用機(jī)理研究[D].長(zhǎng)春:長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),2008.

[9]翁梁,周秋麗,王麗娟,等.鹿茸多肽促進(jìn)表皮和成纖維細(xì)胞增殖及皮膚創(chuàng)傷愈合[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2001,36(11):817-820.

[10]李娜,曲曉波,姜宗文,等.動(dòng)物藥整理研究——鹿角膠[J].吉林中醫(yī)藥,2014,34(1):74-76.