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    針灸“補(bǔ)腎益髓”法對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)腦啡肽酶的作用

    2014-08-09 01:24:26羅琴琴杜艷軍
    吉林中醫(yī)藥 2014年5期
    關(guān)鍵詞:阿爾茨海默造模海馬

    羅琴琴,杜艷軍

    (湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院,武漢 430061)

    阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseases,AD),即老年性癡呆,是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病,多以近事記憶喪失為首發(fā)癥狀,逐漸出現(xiàn)記憶減退、認(rèn)知功能損害、精神行為異常等癥狀,病情呈進(jìn)行性加重?!?013年世界阿爾茨海默病報(bào)告》指出:2010—2050年,全球范圍內(nèi)60歲及以上的老年人群中,13%(約2.77億)的人需要長(zhǎng)期護(hù)理,而這2.77億人中約有一半的人患有阿爾茨海默病。據(jù)報(bào)道,我國(guó)隨著老年化人口的快速增漲,阿爾茨海默病的患病人數(shù)也會(huì)越來(lái)越多,其發(fā)病率與國(guó)際水平相當(dāng)。面對(duì)這一嚴(yán)峻的局勢(shì),雖然國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究者對(duì)其治療方法有了深入的探索,但仍未尋求到一種可以治愈或者阻止其病情發(fā)展的治療方法。目前的研究表明:β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)在腦內(nèi)沉淀形成老年斑是AD主要的病理改變之一,而且Aβ及其興奮性神經(jīng)毒是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡,患者出現(xiàn)記憶衰退的關(guān)鍵[1]。因此,減少Aβ的生成和促進(jìn)其降解,是改善AD病理變化,減少Aβ的神經(jīng)毒的根本途徑。近年研究[2]表明,腦啡肽酶(NEP)是體內(nèi)重要的Aβ降解酶,它通過(guò)催化降解Aβ而調(diào)節(jié)腦內(nèi)Aβ的水平。先前有關(guān)AD的實(shí)驗(yàn)研究[3]顯示,針刺提高了AD大鼠的認(rèn)知能力,從癥狀上肯定了針灸對(duì)AD的療效。本研究根據(jù)補(bǔ)腎益髓的治則,采用傳統(tǒng)針灸療法治療AD模型大鼠,觀察該療法對(duì)大鼠海馬區(qū)NEP表達(dá)的影響,以期為針灸治療AD的臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 由湖北省疾控中心供的SPF級(jí)Wistar大鼠,雄性58只,月齡為12個(gè)月左右,體質(zhì)量為(360±20)g。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng) 1周后,所有大鼠經(jīng)Morris水迷宮測(cè)試,剔除不合格者(即反應(yīng)過(guò)于遲鈍或靈敏者)。將合格的40只大鼠隨機(jī)分為4組:正常組、模型組、假手術(shù)組和治療組。正常組:常規(guī)飲水和飼料, 不給予任何處理;模型組:造模后不給予任何處理;假手術(shù)組:顱內(nèi)注射等量生理鹽水,手術(shù)方法及注藥方法同模型組;治療組:造模后,采用針刺和艾灸方法治療。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均用在非鋁制品的器皿中存放相同的飼料喂養(yǎng),自由飲食, 光線適中。治療結(jié)束后, 各組大鼠在同一天內(nèi)取材。

    1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 主要儀器:WDT-Ⅱ型微電極推進(jìn)器腦立體定位儀(西安西北光電儀器廠),AS325輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(Shandon),IB-PS包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),TI-SR倒置熒光顯微鏡(日本尼康),DS-U3成像系統(tǒng)(日本尼康),WD-9405A脫色搖床(北京市六一儀器廠),BHS-313型Olympus顯微鏡(Olympus,Japan),Image-pro-plus圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics Inc,USA)。主要試劑:Aβ1-42(美國(guó)Sigma公司),BSA(A7030,美國(guó)Sigma公司),CY3標(biāo)記山羊抗兔NEP多克隆抗體(美國(guó)jackson公司),兔抗大鼠NEP多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    2.1 動(dòng)物模型制作 大鼠稱重,用10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后,行俯臥位固定于顱腦立體定位儀上,保持前后囟在同一水平,剪開頭皮,暴露前囟,在前囟后3.3 mm,中線左右各旁開1.5 mm,用牙科鉆鉆一小孔(直徑1 mm),垂直插入微量注射器,使針尖自顱骨表面緩慢進(jìn)針3.3 mm至海馬區(qū),用微量注射器分別注入5 μL聚集肽的Aβ1-42(Aβ1-42先在50 μL二甲基亞砜溶液中混勻溶解,離心機(jī)離心后再放入50 μLPBS緩沖液中稀釋,離心機(jī)離心后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?,5 min內(nèi)注射完,注射后留針5 min,按1.0 mm/min速度緩慢出針,以免拔針時(shí)藥物溢出,術(shù)后牙托粉封固顱骨孔,縫合頭皮,局部外敷青霉素G粉,術(shù)后3 d內(nèi)每天肌注青霉素80萬(wàn)U以預(yù)防感染。

    2.2 動(dòng)物治療方法 治療組大鼠造模后,于“百會(huì)”和雙側(cè)“腎俞”[4]3個(gè)穴先進(jìn)行針刺(1寸毫針),留針15 min后,再用細(xì)艾條(自制直徑約0.6 cm)在穴位上方2~3 cm處行溫和灸,使穴位表皮溫度在(43±1)℃,持續(xù)15 min,1次/d,6 d為1個(gè)療程,療程間休息1 d,共2個(gè)療程。

    2.3 動(dòng)物取材 治療結(jié)束后,將各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3 mL/kg,腹腔注射)中度麻醉后,仰臥固定于鼠板上,自領(lǐng)下至上腹行胸腹聯(lián)合切口,切斷肋骨、膈肌,暴露出心臟,向左心室插入灌注針頭,快速灌入無(wú)菌生理鹽水500 mL沖洗組織內(nèi)血液,同時(shí)剪開右心耳,沖洗至肝臟變白,灌注時(shí)間約10 min,見大鼠尾巴、四肢僵硬視為滿意,完畢后,斷頭取腦,參照大鼠腦立體定位圖譜分離海馬,置于4%中性緩沖甲醛中,浸泡外固定24 h,取海馬標(biāo)本。NEP的陽(yáng)性表達(dá)采用SABC免疫組化和免疫熒光法檢測(cè)(具體按試劑說(shuō)明書操作)。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2種檢驗(yàn)方法中,各組分別隨機(jī)選10張切片,免疫組化切片在100倍光學(xué)顯微鏡下拍攝;免疫熒光切片在200倍的熒光顯微鏡下拍照,拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野。所有照片應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行分析,得出每張照片陽(yáng)性的累積光密度值(IOD值),IOD值越大,表示NEP陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。各組的IOD值統(tǒng)計(jì)見表1。

    結(jié)果表1所示,海馬CA1區(qū)NEP表達(dá)成像的積分密度值可以間接反應(yīng)NEP 表達(dá)量的水平,其值越高表示NEP的含量越多,反之亦然。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,筆者發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組與正常組比較P>0.05,即2者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,2組間結(jié)果沒有明顯的差別,表明在AD模型的制作過(guò)程中,手術(shù)給實(shí)驗(yàn)造成影響可以忽略。模型組與假手術(shù)組相比較,2種檢測(cè)結(jié)果分別是P<0.05和P<0.01,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示造模成功,且模型的成功主要是由于注射了凝聚態(tài)的Aβ1-42。模型組與治療組相比較,2個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為P<0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明經(jīng)針灸治療后,大鼠海馬NEP顯著性增高,從而促進(jìn)Aβ的降解,改善了AD的病理變化,延緩了其病理進(jìn)程。根據(jù)上表中免疫組化的結(jié)果繪制了柱形圖,如圖1所示,更直觀的顯示了免疫組化中各組NEP的表達(dá)情況。

    表1 2種實(shí)驗(yàn)中NEP陽(yáng)性表達(dá)的累積光密度值

    注:與正常組相比較,#P>0.05;與假手術(shù)組相比較,△P<0.05,△△P<0.01;與模型組相比較,▲P<0.01,▲▲P<0.01。

    注:與正常組相比較,#P>0.05;與假手術(shù)組和正常組相比較,△P<0.05;與模型組相比較,△△P<0.091。圖1 各組大鼠海馬區(qū)NEP表達(dá)成像的積分密度值比較

    各組免疫熒光切片在激發(fā)波長(zhǎng)為510~560 nm拍下目的蛋白NEP的表達(dá)(紅光)。若圖中紅色光斑越亮越密集,表明NEP的表達(dá)越多。經(jīng)比較4組圖片中紅光的亮度和密度可以看出正常組和假手術(shù)組的NEP表達(dá)最多,且正常組較假手術(shù)組表達(dá)更顯著,可能存在造模中的手術(shù)創(chuàng)傷的影響,但模型組與假手術(shù)組相比,NEP的表達(dá)明顯減少,其手術(shù)創(chuàng)傷可以乎略,表明此次造模成功;經(jīng)治療后,NEP的表達(dá)較模型組增強(qiáng),說(shuō)明該療法可以促進(jìn)NEP的表達(dá)。

    4 討論

    4.1 補(bǔ)腎益髓法 阿爾茨海默病在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中可歸屬為心神失常、善忘、呆病、癡證等,病位在腦。雖然其病因復(fù)雜,但主要是因腎虛精虧,腦減髓消,神機(jī)失用而致,可見該病與腎和腦密切相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為腎主骨,生髓充腦,且《靈樞經(jīng)·海論》稱:“髓海有余,則輕勁多力,自過(guò)其度;髓海不足,則腦轉(zhuǎn)耳鳴,脛酸眩冒,目無(wú)所見,懈怠安臥?!爆F(xiàn)代科學(xué)方法也表明了腎與腦關(guān)系密切,李航等[5]指出交感神經(jīng)-腎上腺素能系統(tǒng)與腎陰陽(yáng)的虛實(shí)有著明顯關(guān)系,沈自尹[6]發(fā)現(xiàn)腎虛證存在著下丘腦-垂體-靶腺(甲狀腺、腎上腺、性腺等)多軸的功能紊亂。由此可見,補(bǔ)益腎臟,益髓充腦是治療AD的關(guān)鍵,并且此治療原則在先前的多個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究中[7-9]得到了肯定療效。因此,筆者選用位于腦之顛的“百會(huì)”和腎的背腧穴“腎俞”治療AD大鼠,以達(dá)到補(bǔ)腎益髓的作用。

    4.2 NEP與阿爾茨海默病 大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques,SP)是AD顯著的神經(jīng)組織學(xué)病理特征之一。目前,許多研究者認(rèn)為Aβ的沉積是AD病理的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)。因此,減少Aβ的產(chǎn)生、促進(jìn)其降A(chǔ)D的防治有重要的意義。在生理?xiàng)l件下,Aβ在機(jī)體中的產(chǎn)生和清除處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)中,機(jī)體不會(huì)受到損傷性影響。但當(dāng)這一動(dòng)態(tài)平衡被打破,即Aβ的產(chǎn)生增多或者清除減少,則可導(dǎo)致Aβ的異常增多,聚集,最終在細(xì)胞外形成沉積的老年斑,引起一系列的炎癥反應(yīng),在細(xì)胞內(nèi)則產(chǎn)生神經(jīng)毒作用,均能對(duì)神經(jīng)元造成損傷。目前,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已證明了腦啡肽酶可以裂解細(xì)胞外的Aβ,減少其對(duì)神經(jīng)元的損傷。

    腦啡肽酶(NEP)是一種含有鋅離子的Ⅱ型膜蛋白,為中性內(nèi)肽酶M13家族中的一員。作為胞外酶,NEP優(yōu)先水解細(xì)胞外的寡肽(<5 kDa),水解作用發(fā)生在疏水氨基酸殘基的氨基側(cè),因此NEP尤其這一特適合分子量較小的,且含有40~42個(gè)疏水氨基酸的Aβ肽的降解[10],同時(shí)NEP也可以列解內(nèi)啡肽、生長(zhǎng)抑素、緩激肽等一些分子量小于5 kDa的神經(jīng)肽。在腦內(nèi),表達(dá)于NEP主要表達(dá)于黑質(zhì)紋狀體通路及海馬等處神經(jīng)元的突觸前膜和突觸后膜,而這些部位正是易于形成老年斑的區(qū)域,且臨床研究也發(fā)現(xiàn),AD患者腦內(nèi)易于形成老年斑的海馬和顳中回等區(qū)域NEP含量顯著下降[11]。大量實(shí)驗(yàn)表明[12-13],Aβ在腦內(nèi)的水平隨NEP的增多而減少,當(dāng)NEP的基因敲除或使用NEP抑制劑時(shí),Aβ的含量增多。由此可見,NEP對(duì)Aβ的降解中起著重要的作用,目前已廣泛認(rèn)為NEP為Aβ降解的限速酶。

    目前研究發(fā)現(xiàn),多種途徑如自噬溶酶體、泛素蛋白酶體系統(tǒng)等和各種生物活性分子如腦啡肽酶、前序列蛋白酶、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶、胰島素降解酶、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶-9等,共同構(gòu)成了Aβ的降解系統(tǒng)。本研究表明經(jīng)“補(bǔ)腎益髓”的針灸療法治療后,AD大鼠海馬區(qū)NEP的表達(dá)顯著增加,說(shuō)明該治療可通過(guò)提高NEP的含量,促進(jìn) Aβ降解,減少其對(duì)神經(jīng)元的毒性損傷,延緩AD的病理進(jìn)程。而NEP作為Aβ降解系統(tǒng)中的一員,由此可以推論該針灸療法可能具有上調(diào)Aβ降解系統(tǒng)功能的作用,從而全面促進(jìn)Aβ的降解,因而緩解AD的病理進(jìn)程。

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