陳元膏摩對膝骨性關節(jié)炎大鼠軟骨Ⅰ、Ⅱ型膠原的影響

張超凡，王新軍,2，劉俊昌,2*

(1.新疆醫(yī)科大學，烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院 新疆名醫(yī)名方與特色方劑學實驗室，烏魯木齊 830001)

膝骨性關節(jié)炎(KOA)是臨床上常見的慢性中老年疾病,其以膝關節(jié)的僵硬、疼痛、腫脹和功能障礙為主要表現，后期嚴重者可明顯影響生存質量并致殘[1]。目前，KOA已受到“國際骨與關節(jié)十年”組織，聯合國以及各發(fā)達和發(fā)展中國家政府的普遍重視。我國國內六大城市KOA的總患病率為15.6%[2];北京市城區(qū)60歲以上人群中，有KOA影像學表現的男女性患病率分別為21.5%和42.8%，其中女性的臨床患病率比Farminghan研究中的女性高出了40%[3]。隨著人口老齡化的進程,KOA的患病人數正在不斷上升，隨之給患者帶來的治療壓力和經濟、心理負擔也越來越大。相對于關節(jié)鏡手術、關節(jié)置換等西醫(yī)療法，推拿、針灸、中藥外治等中醫(yī)外治療法具有經濟、安全、見效快等特點。目前的外用中藥多為單味藥及提取物的制劑，而復方制劑相對稀少；而且，膏摩作為外用中藥與推拿相得益彰的結合，也曾一度被忽視，再而能夠通過合理的試驗對其療效機理進行驗證和解釋的研究更是寥寥無幾。陳元膏摩方是由蒼梧道士的古方化裁而來，方含：川芎、秋水仙、黑附片等多種藥物,是臨床治療KOA有效的組方[4]。本研究希望可以通過觀察陳元膏摩對KOA大鼠膝關節(jié)軟骨中Ⅰ、Ⅱ型膠原的影響，來探討其對關節(jié)軟骨是否有保護作用，從而為此療法臨床治療KOA提供切實的科學依據。

1 實驗材料

1.1 動物 健康清潔的成年SD雌性大鼠52只，體質量為300～350 g,由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2 藥物 陳元膏摩方(方含川芎、秋水仙、黑附片等藥物，以當歸為君藥，凡士林、羊毛脂為基質,根據油脂軟膏的制作工藝，委托新疆醫(yī)科大學中藥實驗室一次性制作完成)、凡士林(由新疆醫(yī)科大學中藥實驗室提供)。

1.3 主要試劑 Ⅰ型膠原山羊多克隆抗體，Ⅱ型膠原兔多克隆抗體(美國santa cruz公司)，SP-9000免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.4 主要儀器和耗材 樹脂石膏繃帶，珠海麗珠生物材料有限公司;光學顯微鏡,日本尼康公司E200；病理圖文分析軟件，湖南千屏有限公司；圖片分析軟件。

2 實驗方法

2.1 分組及造模 52只健康清潔的雌性SD大鼠，購買后適應性喂養(yǎng)3 d，隨機分為4組：正常組(A組)、模型組(B組)、陳元膏試驗組(C組)和手法對照組(D組)各13只。采用石膏屈曲位固定法對B、C、D組的大鼠進行KOA的造模。方法如下：管型石膏屈曲位固定大鼠左下肢膝關節(jié)，范圍從踝關節(jié)直至腹股溝處，并以鐵絲和繃帶外固定。每日檢查石膏的固定情況，若有石膏脫落、咬損或下肢腫脹等情況立即重新固定。

2.2 干預方法 8周后統一拆除石膏，正常組(A組)和模型組(B組)不作處理;陳元膏試驗組(C組)和手法對照組(D組)定期剔除大鼠左下肢膝關節(jié)周圍的毛發(fā)，在以髕韌帶為中心約4 cm2的范圍內，分別均勻涂以陳元膏劑和凡士林2 g/只，并均結合手法治療，每天1次，持續(xù)8周。手法由同一名接受過專業(yè)推拿培訓的實驗員進行操作，具體手法如下:1)治療者分別用拇指和食指按揉膝關節(jié)周圍軟組織及大腿、小腿周圍肌肉，力量以局部皮膚發(fā)熱或藥物顏色吸收變淺為度，重復60次。2)治療者手握大鼠足掌，帶動大鼠膝關節(jié)做屈伸運動，屈伸程度以大鼠無嘶叫或撕咬掙扎為度，重復20次。手法操作完畢后，為防止大鼠舔食殘留藥物而妨礙吸收，將其在制動瓶中制動1 h，再擦盡藥漬放回籠中。

2.3 取材與標本處理 干預滿8周后，麻醉4組大鼠，切取左膝整個股骨髁,4%多聚甲醛固定48 h，進行脫鈣及石蠟包埋、切片。

2.4 觀察指標 切片后,HE染色并在光鏡下對其組織結構進行詳細的觀察。每張切片選擇3個不同的視野，并參照Mankin關節(jié)軟骨病理評分標準[5]進行積分統計。切片進行Ⅰ、Ⅱ型膠原的免疫組化染色，在顯微鏡下觀察染色結果并照片，計算陽性染色積分光密度(采用IPP6.0軟件進行測定)。

2.5 統計學分析 所有數據進行單因素方差分析或非參數檢驗，再進行組間兩兩比較。檢驗水準α=0.05,用SPSS 17.0統計軟件進行分析。

3 實驗結果

3.1 HE染色觀察 正常組關節(jié)軟骨HE染色其軟骨細胞形態(tài)完整，分布均勻且排列整齊；模型組軟骨層明顯變薄，結構不規(guī)則且多有裂隙，其中，深層軟骨細胞開始萎縮變小且數目明顯減少；陳元膏試驗組和手法對照組均可見軟骨表層不平整，中層細胞排列不齊且包含較多的同源軟骨細胞。見圖1。

3.2 軟骨中Ⅱ型膠原的表達 正常組關節(jié)軟骨Ⅱ型膠原免疫組化染色呈棕黃色網狀纖維，均勻分布于軟骨全層；模型組軟骨全層著色明顯減弱，Ⅱ型膠原僅在軟骨深層的個別同源軟骨細胞及其周圍基質中有輕微表達；陳元膏試驗組和手法對照組Ⅱ型膠原主要表達在軟骨中、深層的多數軟骨細胞、同源軟骨細胞及基質中，其中陳元膏試驗組相對于手法對照組染色較深，分布較多，但都沒有正常組明顯。見圖2。

圖1 各組關節(jié)軟骨HE染色(×400)

圖2 各組關節(jié)軟骨免疫組化Ⅱ型膠原染色(×400)

3.3 軟骨中Ⅰ型膠原的表達 Ⅰ型膠原免疫組化染色為棕黃色網狀或條絮狀纖維，且均分布于軟骨下骨中，而在軟骨層其染色均為陰性。4組中模型組軟骨下骨中有均勻的大面積棕色著色；手法對照組有部分的棕色著色，其陽性面積大約占到骨基質的1/3;而陳元膏試驗組僅有少部分骨基質呈淡棕色，且著色面積較少，其余區(qū)域則完全呈陰性；正常組軟骨下骨中未見十分明顯的陽性著色。見圖3。

圖3 各組關節(jié)軟骨免疫組化Ⅱ型膠原染色(×100)

3.4 軟骨Mankin評分及Ⅰ、Ⅱ型膠原表達的比較 Mankin評分：模型組評分明顯高于正常組(P<0.01)；而陳元膏試驗組和手法對照組均明顯低于模型組(P<0.05)。Ⅱ型膠原的表達：模型組的表達明顯低于正常組(P<0.01)，而陳元膏試驗組和手法對照組均顯著高于模型組(P<0.01)；其中以陳元膏試驗組的表達較高(P<0.05)。Ⅰ型膠原的表達：正常組、陳元膏試驗組和手法對照組均明顯低于模型組(P<0.05)，其中以陳元膏試驗組和手法對照組的表達較高，具體見表1。

表1 各組大鼠關節(jié)軟骨Mankin評分、Ⅱ型膠原及軟骨下骨Ⅰ型膠原的表達

4 討論

KOA以膝關節(jié)軟骨的退行性病變?yōu)橹鳎蛐湍z原是軟骨組織最主要的成分,約占膠原總量的90%，可作為軟骨的表型標記，是評價軟骨修復質量的標志之一[6]。Ⅰ型膠原由于含量不到膠原總量的1%，正常情況下也較少檢測到，所以一般認為正常關節(jié)軟骨中不含Ⅰ型膠原[7]。骨性關節(jié)炎(OA)不但導致軟骨中Ⅱ型膠原明顯丟失,同時也引起軟骨細胞去分化合成Ⅰ型膠原[8]。

膏摩療法最早記載于先秦《五十二病方》[9],指用不同藥膏作為介質，以增加療效的一種推拿方法。膏摩療法的最大特點在于其發(fā)揮了藥與摩的綜合作用。一方面手法可加快和促進藥物的深入滲透，另一方面藥物也可協助手法達到活血化瘀、祛風除濕等功效。中唐時期的《外臺秘要卷三十一，古今諸家膏四首》提到：“處地下濕，身病苦痹……思取藥摩之。日至再，十五日平復?！倍筮@張膏摩方被收錄于《千金翼方·卷十六·諸膏第三》中。

本研究的陳元膏摩方即由上述古方化裁而來，組方中除了川芎、當歸、黑附片等活血化瘀、舒筋通絡的中藥材外，還加入了維藥秋水仙。維吾爾醫(yī)學認為，秋水仙屬性可清除異常黏液質[10]，抽祛機體深層稠黏異常體液?，F代藥理研究表明：川芎的有效成分川芎嗪能通過降低OA軟骨中MMP-1的水平,增加TⅠMP-1的水平,起到保護和修復早期OA關節(jié)軟骨的作用[11]。但陳元膏摩是組方與手法結合的療法，其療效機理正有待進一步驗證。本試驗中,陳元膏試驗組軟骨中Ⅱ型膠原含量及Mankins評分與模型組相比都有明顯差異(P<0.05)，提示陳元膏摩可通過增加關節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原的表達，維持正常的軟骨膠原表型，起到保護關節(jié)軟骨的作用。

有關OA關節(jié)軟骨中是否存在Ⅰ型膠原其實尚存爭議。Adam M等[12]應用生化方法檢測出OA關節(jié)軟骨中含有Ⅰ型膠原，而同樣的方法Goldwasser M等[13]卻沒有測出。后來，人們用免疫組化方法測定人體OA標本后，也得出相矛盾的結論[14-15]。近年來，郭秦煒[16]、裴明[17]等國內學者的研究顯示：在原發(fā)性OA時，Ⅰ型膠原的表達僅限于軟骨下骨，而軟骨細胞和細胞外基質中Ⅰ型膠原染色均為陰性。本研究的結果即與此結論相一致，模型組和治療組中，Ⅰ型膠原都僅在軟骨下骨中呈現陽性，而在簇聚軟骨細胞和和軟骨基質中均呈現陰性，這也在一定程度上否定了Adam等提出的OA軟骨中Ⅰ型膠原是由簇聚軟骨細胞合成的結論。雖然Mayne等在體外培養(yǎng)的OA軟骨細胞能合成大量的Ⅰ型膠原，但是在體內的原發(fā)性OA的軟骨細胞并不能合成Ⅰ型膠原。這種差異可能是因為細胞的膠原合成過程會受到周圍環(huán)境的影響，而體外培養(yǎng)的軟骨細胞所處的環(huán)境與體內存在很大差異[16]。而利用生化的方法之所以能從OA軟骨中檢測測出少量的Ⅰ型膠原，可能是因為在取材時軟骨中混入了少量軟骨下骨或者韌帶組織所造成的。

另外，本試驗模型組中，有2個樣本Ⅱ型膠原的表達不降反增，筆者推測這可能是軟骨細胞的代償表現。Ⅱ型膠原在軟骨細胞被破壞到一定程度之前，其合成量仍大于分解量，而到OA晚期，軟骨細胞的結構和功能受到嚴重破壞時，其總量才會隨著合成量的減少而減少。本試驗的結果中，軟骨下骨內Ⅰ型膠原的表達與OA的嚴重程度呈正相關，這可能是由于軟骨下骨的自身修復所造成的。軟骨下骨組織在承受較高壓力的情況下會發(fā)生微骨折[18]，其在修復早期形成的纖維軟骨細胞是能夠合成Ⅰ型膠原的[19]。

OA關節(jié)軟骨結構的變化較為復雜，既可見到軟骨細胞的固縮、破裂、壞死，又伴有部分軟骨細胞的活躍、基質內膠原纖維的增加。目前，這些“軟骨—軟骨下骨單位”和“骨—軟骨連接處”的生物學研究已逐漸受到重視，相信在不久的將來一定可以得到徹底的研究，并為KOA的治療提供科學的依據。

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